2016 Fiscal Year Annual Research Report
アルツハイマー病脳老人斑構成成分ＣＬＡＣ－Ｐの中枢神経系における生理機能の解明
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15J05680
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
宗實 悠佳 東京大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | コラーゲン / 神経系 / 神経生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
報告者はこれまでに、CLAC-P/Collagen XXV (以下、Collagen 25)がシナプス接着分子である、受容体型チロシンホスファターゼ (RPTP)の結合分子であることを見出した。これより、Collagen 25がRPTPと協調的に働き、神経系において重要な機能を担う可能性を着想し、研究を進めている。
報告者は、RPTPを発現させた培養細胞へリコンビナント ecto-Collagen 25を添加する実験から、両者がRPTPのIgドメインを介して特異的に結合することを見出した。RPTPは軸索伸長という文脈において、ヘパラン硫酸やコンドロイチン硫酸とIgドメインを介して結合する。またCollagen 25もこれらグリコサミノグリカン (GAG)と結合することから、RPTPとCollagen 25の結合にGAGが関わっている可能性を検証した。プロテオグリカンとの結合を失うRPTP変異体を細胞に発現させ、ecto-Collagen 25の添加実験を行ったところ、結合は有意に減少した。このことは、両者の結合にプロテオグリカンという第三の分子が関わっていることを示唆するものと思われる。
近年、Collagen 25の変異がヒトの先天性脳神経支配異常症の原因となるという報告 (Shinwari et al., 2015)を受け、変異型Collagen 25の生化学的解析、及び、RPTPとの相互作用について検討を行った。トリプシン消化実験より、G382R変異はコラーゲン構造が崩れていることが分かった。一方、G497stop変異は野生型と同等に安定したコラーゲン構造を有していた。しかし、G497stop変異はRPTPとの相互作用能を完全に失っていた。このことから、Collagen 25とRPTPとの結合には、Collagen 25のC末端が必要であることも明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H28年度の研究計画は、① 変異型Collagen 25の生化学的解析・及び機能解析 ② 神経系におけるCollagen 25の機能アッセイ であった。
まず①については、生化学的な解析、及び、RPTPとの相互作用の評価を終了することができた。具体的には、トリプシン消化でコーランゲン様三量体構造の安定性評価を行い、変異の一つであるG382Rで三量体構造が大きく崩れていることを示した。また、G382R、G497stopでは、機能的関連が示唆されているRPTPとの相互作用が大きく減少していることを明らかにし、変異Collagen 25の解析を大きく発展させることができた。
一方②に関しては、機能的関連が示唆されているRPTPとの結合様式の検討を更に進めることができた。H27年度に得た結果から、RPTPとCollagen 25が、RPTPのIGドメインを介して結合していることが分かっていたが、本年度は新たに、両者の結合にグリコサミノグリカン (GAG)が関与している可能性を示唆することができた。これは、培養細胞を用いたin vitro実験系から得られた結果ではあるが、in vivoの神経系における結合様式を反映した結果であることが期待される。また、これまでの検討から、Collagen 25は当初着目していたシナプスではなく、軸索誘導など、シナプス形成とは異なる文脈で、RPTPと協調して機能している可能性が高まってきた。初代培養神経細胞とCollagen 25を発現させたHEK293細胞との共培養実験系で、Collagen 25発現HEK293細胞周辺に軸索が誘導される傾向を見出しており、評価系の確立に着手した。
以上の研究の進展状況から、当初予期しなかった新たな発見も含めて、研究は、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究から、Collagen 25は、RPTPと協調して神経系において機能している可能性が示唆されている。H29年度は、① RPTPとCollagen 25が、他の細胞外マトリックス分子と機能的複合体を形成しながら、協調して働いているという仮説について、結合実験から更に詰めていくことを目指す。また、② 軸索誘導に着目した、Collagen 25の機能アッセイを更に展開していくことに注力していく。
具体的には、① RPTPとCollagen 25の結合にGAGが関与している可能性を更に検証するために、内因性GAGを欠く培養細胞株を用いた検討を行う。同時に、HEK293細胞で内因性GAGの合成を阻害し、RPTPとCollagen 25の相互作用への影響を検証するなど、複数の実験系で、仮説の証明を試みる。 ② これまでの検討から、Collagen 25は、当初着目していたシナプス形成ではなく、軸索誘導など、シナプス形成とは異なる文脈で、RPTPと協調して機能している可能性が高まった。H28年度は、軸索誘導機能評価のために、初代培養神経細胞と、Collagen 25を発現させたHEK293細胞との共培養実験、及びその評価系の樹立を進めてきた。本年度は、培養細胞に発現させたCollagen 25の機能解析を行うと共に、RPTP依存的な現象であることを証明するために、RPTP KOマウス由来の神経細胞を用いた検討を行うことを予定している。
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Research Products
(2 results)
