間葉系幹細胞から線維芽細胞への分化における主要制御因子の探索

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J06086
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 中島 拓弥 東京大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: 間葉系幹細胞 / 転写因子 / 細胞分化

Outline of Annual Research Achievements

昨年度、候補因子として抽出した約100の転写因子をより絞り込むために、col1遺伝子の-1000から+100の配列に結合配列を持つ32の転写因子を抽出した。これらの遺伝子の発現を抑制するためにピューロマイシン耐性遺伝子をマーカーとするレンチウイルスshRNAベクターを用いてウイルスを作製し、MSCへ感染させた。ピューロマイシンによるセレクションの後、サイトカインを含む培地で培養し、GFP陽性細胞への誘導を行った。GFP陽性細胞への誘導の抑制が確認できたcdkn2a、egr2、sox2、tbx2を対象とした。
実験をより簡便且つ効率的に行うため、ベクターのマーカーを細胞表面マーカーであるlow-affinity nerve growth factor receptor (LNGFR)に改変した。shRNA発現ベクターライブラリーの中から抑制効果の高いベクターを選択するために、各ベクターのDNAを調整後、一過性に遺伝子を導入した。その後、LNGFRを用いて磁気分離法により遺伝子が導入された細胞を純化し、RT-qPCRによって転写因子の発現を定量し、最も抑制効果の高いベクターを選択した。
sox2に対しては全てのベクターで抑制効果を得られなかったため、この時点で候補から除外した。
ウイルスを作製し、MSCへ感染させ、LNGFRを用いて磁気分離法により感染細胞を純化した。その後、サイトカインを含む培地で培養し、GFP陽性細胞への誘導を行った。egr2、tbx2の発現抑制では、GFP陽性細胞への誘導が抑制され、コラーゲンの沈着量も減少していた。cdkn2aの発現を抑制したところ、GFP陽性細胞への誘導が亢進された。この時、コラーゲンの沈着量も増加していた。ターゲット遺伝子の発現を抑制してもGFP陽性細胞への誘導が抑制できなかったため、cdkn2aは候補から除外した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

分化を抑制し得る転写因子は絞り込めたが、それらの遺伝子発現制御に伴うその他の間葉系の細胞への多分化能への影響までは至ることができなかった。また、それらの転写因子に関して、遺伝子欠損細胞や遺伝子改変マウスを作製することには着手できていない。

Strategy for Future Research Activity

ウイルス感染・純化などの作業における培養が間葉系の細胞への多分化能に影響を与えてしまうため、転写因子の発現制御の影響によるものなのかが直接的に判断しにくい。感染させる細胞のスケールを増やすことで、培養のステップをいくつか短縮できるものと考える。
遺伝子欠損細胞や遺伝子改変マウスの作製には時間がかかるため、中和抗体、阻害剤等の機能抑制法を中心に実験を進める。