2015 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内シグナル伝達ネットワークの光制御に向けた分子創成
| Project/Area Number |
15J06657
|
|---|
| Research Institution | Nagoya Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
吉田 一帆 名古屋工業大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2018-03-31
|
| Keywords | オプトジェネティクス / シグナル伝達 / ロドプシン / GPCR / 蛍光イメージング / 機能創成 / 生物物理 / バイオ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では細胞内Gタンパク質のシグナル伝達ネットワークを光で制御する分子をデザインし、オプトジェネティクスに有用なツールを開発することを目的としている。本年度の研究成果の概要を以下に記述する。
1. これまでにGs活性型キメラタンパク質の構築のため、beta2-アドレナリン受容体（b2AR）の細胞質側ループを微生物型ロドプシンに組込んだ分子を作製し、それらがIn vitroの系で活性化能を持つことを示した。ツールとして用いるためには細胞内における活性化が必須である。そこで哺乳類の培養細胞を用いて、カルシウム蛍光指示薬による蛍光観察法の導入を試みた。Gsのシグナル伝達経路ではカルシウム濃度は直接的に上昇しないが、cAMP依存性カルシウムチャネルを共発現させることにより細胞外からカルシウムが流入するため蛍光観察が可能となった。実際にキメラタンパク質の細胞内活性評価を行ったところ、b2ARにアゴニスト刺激をした際の10分の1程度と弱いながらも活性が見られた。この活性はツールとして用いるにはまだ低いが、GPCRの極一部だけを配列に相同性のない微生物型ロドプシンに挿入しただけで得られたと考えると、GPCRと微生物型ロドプシンの構造変化の類似性を伺わせる結果である。この研究結果は現在論文にまとめている段階である。
2. Gタンパク質は大きく4種のサブタイプに分けられており、様々な下流のシグナルを誘導する。Gsとは異なる種類のGタンパク質を活性化することを目指し、新たなコンストラクトを作製し、それらが培養細胞に発現することを確認した。今後、カルシウム蛍光観察により活性を評価していく。また、cAMP濃度依存的に発光強度が変化する改変型ルシフェラーゼから成るGloSensorを用いた発光観察の立ち上げもすでに完了しているので、直接的にcAMPの濃度変化を観察することでも活性を評価していく。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度では細胞内活性化測定を行うための蛍光観察法の立ち上げに成功し、細胞内のカルシウム濃度変化をリアルタイムで捉えられるようになった。実際にin vitroで活性の見られたGs活性型のキメラタンパク質の細胞内活性を調べたところ、弱いながらもカルシウム濃度が増加するシグナルが得られた。さらに、cAMP濃度依存的に発光強度が変化する改変型ルシフェラーゼから成るGloSensorを用いた発光観察の立ち上げも完了しているので、直接的にcAMPの濃度変化を観察することが可能となった。また、様々な種類のGタンパク質を活性化することを目指した新たなコンストラクトを作製し、すでにそれらの細胞への発現を確認している。以上のように、細胞内Gタンパク質のシグナル伝達ネットワークを光で制御するツールの開発に向けた研究が順調に進んでいることが理由である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度では細胞内活性を測定するための手法を確立した。これまで対象としてきたGsとは異なる種類のGタンパク質を活性化することを目指し、シグナル伝達の下流でカルシウム濃度の上昇が期待されるGq活性型、およびcAMP濃度の減少が期待されるGi活性型分子の新たなコンストラクトを作製し、それらが培養細胞に発現することをすでに確認している。平成28年度では、カルシウム蛍光指示薬による蛍光観察法、およびcAMP濃度依存的に発光強度が変化する改変型ルシフェラーゼから成るGloSensorを用いた発光観察により細胞内活性を調べていく。
活性の見られたキメラタンパク質について分子特性を調べる。キメラタンパク質を発現させた細胞にガラス電極を刺し、細胞内の電位を一定に保った状態で電流値を測定するパッチクランプ法を用いて、キメラタンパク質のイオン輸送能を調べる。また、分光学測定を行うには単離精製する必要があるので、キメラタンパク質のC末端部位に1D4タグを付加し、抗体カラムにて精製できるようにデザインする。精製できた試料については脂質再構成を行い、発色団の状態やタンパク質の微細な構造変化などを捉えることのできる赤外分光法や、中間体の生成や減衰の時間発展が分かる過渡吸収測定法などを用いて分子特性を調べていく。それらの情報を次の分子デザインにフィードバックすることで、より活性化能の高いキメラタンパク質の構築を目指す。
これまではGタンパク質の活性化能のみに着目してきたが、鋳型となる微生物型ロドプシンのイオン輸送能を極力保った二機能性のキメラタンパク質をデザインする。これまでは主にポンプ型の微生物型ロドプシンを鋳型として用いてきたが、一光子でより多くのイオンを輸送することができるチャネル型の微生物型ロドプシンを用いることで有用なツールをデザインする。
|
