ゼブラフィッシュにおける母性ｍＲＮＡ分解機構の研究

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J08260
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 大籠 健司 東京大学, 新領域創成科学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: 母性mRNA分解 / ORF依存的分解 / ゼブラフィッシュ / 翻訳 / MZT

Outline of Annual Research Achievements

多細胞生物の胚は、受精後しばらく、転写が不活性化状態にある。そのため、発生初期のタンパク質合成は、卵形成時に卵内に蓄積された母性mRNAに依存する。しかし、これらの母性mRNAの大半は新規の転写活性化と同調して選択的かつ急速に分解される。この母性mRNA分解には、microRNAが引き金となっていることが知られているが、miRNAによって分解される母性mRNAはほんの一部にすぎない。そこで本研究では、ゼブラフィッシュをモデルとして、miR-430非依存的な未知の母性mRNA分解機構を明らかにすることを目的とし、今年度は以下の成果を得た。
【選抜したモデル遺伝子rnf180詳細な解析】
miRNAによるmRNA分解に不可欠なタンパク質であるTNRC6の欠失変異体におけるrnf180 mRNAの分解を解析した結果、miRNA非依存的に分解されることが示唆された。これまでの実験で、rnf180 mRNAの分解には新規の転写が必要であることを明らかにしている。そこで、新規の翻訳は分解に必要であるか調べるため、翻訳阻害剤を用いた翻訳阻害実験を行った。その結果、rnf180 mRNAの分解は翻訳阻害時に抑制された。さらに、モルフォリノオリゴを用いてrnf180 mRNAのみの翻訳を阻害したところ、分解が抑制された。以上より、rnf180 mRNAの分解には自身の翻訳が必要であることが示唆された。
【rnf180 mRNA分解を誘導するシス配列の解析】
分解を誘導するシス配列を決定するため、レポーター実験を行った。rnf180の3´UTRをGFPのORFに融合したレポーターでは内在のmRNAのポリ(A)鎖の挙動は再現されなかった。そこで、ORFと3´UTRをもつレポーターを用いた結果、内在の挙動が再現された。次に、ORFの必要十分性を検証するため、rnf180のORFと安定な遺伝子であるvasaの3´UTRを組み合わせたレポーターを用いた。その結果、内在のrnf180 mRNAと同様の挙動が見られた。以上より、rnf180 mRNAの分解には自身のORFが必要であることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初は初年度までに数塩基レベルでシス配列を決定することを計画していたが、レポーターで内在のmRNAの挙動を再現するために時間を要してしまった。一般的に、mRNAの分解を誘導するシス配列は3´UTR上に存在することが多いため、3´UTRのみをもつGFPレポーターで再現を試み、条件検討を重ねていたが、あらゆる可能性を考慮して始めから5´UTR、ORF、3´UTR全てにおいてレポーターを作製し実験すべきであったと考えている。また、in vitroで転写したレポーターmRNAの一部は受精卵内においてポリ(A)鎖が付加されないという問題が生じたため、ポリ(A)鎖の長さの変化を解析するPAT assayにおいて目的のポリ(A)鎖の長さの変化を見ることができなかった。そこで、3´ RACE PCRであるPAT assayで用いるリバースプライマーにTを4~8個付加し、ポリ(A)鎖が付加されていないmRNAを検出しないようにすることで、この問題を暫定的に解決した。
当初の計画よりもやや遅れてはいるが、レポーター系の構築と実験系の最適化には成功しているため、次年度に遅れを挽回できると考えている。

Strategy for Future Research Activity

1年目の研究において、rnf180 mRNAの分解には自身が翻訳される必要があり、また自身のORFを必要とすることが示された。近年、mRNAの安定性とコドンの適用度の関係が注目されており、安定性の低いmRNAはコドン適用度が低いことが報告されている (Presnyak et al., 2015)。また、ゼブラフィッシュにおいて母性mRNAの安定性とコドン適用度に相関があることも最近報告されている (Mishima et al., 2016)。したがって、rnf180 mRNAの分解とコドン適用度に相関がある可能性が考えられる。一方で、ORF上に分解を誘導するシス配列が存在する可能性も考えられる。そこで、2年目ではまず、ORF上に分解を誘導するシス配列が存在するかどうかを明らかにするため、rnf180 のORFを部分的に欠失させたレポーターを作製し、レポーターmRNAの分解・脱アデニル化を解析する。また、コドン適用度とrnf180 mRNAの分解の関係について調べるために、Codon Adaptation Index (CAI) を指標にしてアミノ酸配列を変えずに同義コドンを入れ替えたいくつかのレポーターを作製し、レポーターmRNAの分解・脱アデニル化を解析する。これらの実験によって、分解に必要なシス配列や分解に必要な条件を明らかにし、より詳細な母性mRNAの分解機構に迫ることができると考えている。