マラリアの病態形成における宿主因子ＭＲＰの役割に関する研究

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J08617
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 溝渕 悠代 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: myeloid-related protein / malaria / Plasmodium berghei / splenomegaly / hepatic injury / endothelial cell

Outline of Annual Research Achievements

H28年度は、①MRPによるMΦ活性化の解析、②MRPによる内皮細胞活性化の解析、、③MRP KOマウスへのマラリア原虫感染　を行った。
①に関して、MRP投与マウスにおいて、MRP陽性MΦの集簇が同様に誘導される臓器にも関わらず、肝臓ではiNOS・IL-6・IL-12・TNFα・IL-1bといったM1 markerの発現促進が認められた一方、脾臓ではそれらM1 markerの促進は認められず、むしろM2 markerであるArg1の発現が促進していた。以上のことから、MΦ活性化の極性は組織により異なっていることが示唆された。
②に関して、感染マウスにおいて、claudin5・occludin・ZO-1といった内皮細胞間接着因子の減少が認められ、これが血管透過性亢進に関与することが示唆された。その一方で、内皮・白血球の接着因子であるICAM-1, VCAM-1やROS産生に関わるNOX1の発現パターンは脾臓と肝臓で異なっており、組織による内皮細胞活性化の違いが示唆された。
③に関して、MRP KOマウスにP. bergheiを感染させたところ、KOマウスでも脾腫が認められ、血清中AST・ALT濃度、巣状壊死レベルに野生型マウスとの有意差は認められなかった。。脾臓・肝臓のMΦ数にも有意差は認められず、CCL2・CCR2・IL-12 p40・IL-6・IL-1・iNOSの発現にも有意差は認められなかった。尚、CCR2アンタゴニスト、MRPアンタゴニストを用いた中和実験も行ってみたが、どちらもMRP KOマウスでの上記結果と同様であった。以上の結果から、MRPはマラリアにおける肝障害を誘導するが、この現象にMRPは必須ではないことが明らかになった。おそらく代償的に集簇したMRP陽性MΦ以外のMΦが炎症反応に寄与していると考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は当初の計画通り、・MRPとによる血管内脾細胞活性化の解析・MRP KOマウスおよびMRPアンタゴニストを用いた感染実験を行うことができた。今までにMRP陽性MΦとマラリア病態の相関について明らかにしてきたが、本年度はさらに、その炎症反応がMRP分子の活性で再現できることを明らかにできた。MRPが炎症性サイトカイン産生を誘導することにとどまらず、それらの免疫応答が組織によって異なることを明らかにしたことは、原虫感染における組織特異的病態形成メカニズムを明らかにする上で重要である。
一方で、MRP KOマウスにおけるマラリア原虫感染実験では、その病態に野生型マウスとの差が認められなかった。この結果は当初の予想には反するものの、MRPの機能を理解する上で非常に重要なものであった。実際、MRPの機能についてはこれまでC57BL/6マウスにおける研究がなされていたものの(Hobbs et al., Mol. Cell. Biol., 23(7):2564, Manitz et al., Mol. Cell. Biol., 23(3): 1034)、本研究課題でCRISPR/Cas9システムにより作製したMRP KO BALB/cAマウスではこれら先行研究と異なる結果が得られている。現在、MRP KOマウスを用いた病態モデルの研究が報告されているが、全てこのHobbsらもしくはManitzらのKOマウスを用いた報告である。以上のことから、MRPの性状解析も含めた包括的な研究の必要性が再認識された点で、進展が見られたと言える。

Strategy for Future Research Activity

上記の通り、先行研究で報告されているC57BL/6バックグラウンドのMRP KOマウスと本研究課題でCRISPR/Cas9システムにより作製したMRP14 KO BALB/cAマウスは異なる結果を示すことから、このMRP KOマウスを用いてMRP KOマウスを用いて以下のMRPの性状解析を行う計画である。
①LPS誘導性ショックへの抵抗性の検証：従来のMRP KOマウスはLPS誘導性ショックに抵抗性であるという報告があったことから (Vogl et al., Nat. Med.,13(9):1042) 、本研究で作製したKOマウスでも同様であるか検証する。生存率、病理解析、血清中AST・ASTレベル、サイトカイン発現を解析する予定である。
②LPS刺激による骨髄細胞活性化の解析：従来のMRP KOマウスはLPS刺激による骨髄細胞産生TNFαが抑制されるという報告があったことから (Vogl et al., Nat. Med.,13(9):1042) 、本研究で作製したKOマウスでも同様であるか検証する。
③骨髄細胞・PEC（腹腔滲出細胞）の解析：骨髄細胞・PECは通常MRPを強く発現している細胞が多い。KOマウスにおける骨髄細胞・PECのMRP・CD11b（単球マーカー）・Gr-1 （好中球マーカー）等の発現解析・および細胞形態解析を行い、細胞Populationに違いがないか検証する。