2015 Fiscal Year Annual Research Report
多価不飽和脂肪酸の生理機能解析に資する新規脂肪酸プローブの開発と応用
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15J09839
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
徳永 智久 京都大学, 化学研究所, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | エイコサペンタエン酸 / ω‐エチニル型EPA / クリックケミストリー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エイコサペンタエン酸（EPA）は抗炎症作用など様々な効能を有する生理活性物質として、近年、大きな注目を集めている。EPAは脂質メディエーターの前駆体として機能するとともに、リン脂質のアシル鎖として生体膜の生理機能発現に重要な役割を担っていると考えられている。しかし、EPA の生理機能発現に関わる分子メカニズムの詳細は不明である。本研究では、EPAのω末端にエチニル基を導入したω-エチニル型EPA（cEPA）を開発した。cEPAを用いることによりクリックケミストリーを用いた化学修飾が可能であり、EPAの挙動解析やEPA修飾タンパク質の探索などの様々な解析に応用可能であると期待される。EPA生産性細菌をモデル細菌とし、cEPA の生理機能評価を行った。本菌は、低温誘導的にEPA含有リン脂質を生合成し、本菌のEPA生合成酵素を欠損させたEPA欠損株（ΔEPA）では低温で生育速度が遅延し、異常に伸長した細胞を形成する。このΔEPAをEPA含有培地で生育させるとこれらの生育阻害が抑制される。本年度は、cEPAを含むEPAアナログの合成とΔEPAを用いたcEPAの生理機能解析に取り組んだ。
初めに、cEPAの効率的な合成法の確立に成功した。また、この合成法を応用することにより、EPA重水素ラベル体の合成に成功した。
次に、cEPAの生理機能評価を行った。cEPA含有培地でΔEPAを4℃で培養した結果、ΔEPAの生育速度の遅延や異常な細胞伸長が抑制された。また、cEPA含有培地で培養した菌をBligh-Dyer法によるリン脂質抽出を行い、ESI-MSに供した結果、cEPA含有リン脂質が検出された。このことから、外部添加したcEPAはEPAと同じようにリン脂質のアシル鎖として取り込まれていることが分かった。以上の結果より、cEPAはEPAと同等の機能を示すことが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
機能性脂質として注目されているEPAの生理機能解析に有用な新規プローブ（cEPA）の効率的な合成法を確立した。従来法に比べると収率が約5000倍に向上し、mg単位での合成が可能になった。このことにより、種々の生化学実験にcEPAを供する基盤を築いた。また、この合成法を応用することによりEPA重水素ラベル体の合成にも成功した。このことから、この合成法を利用することにより、目的に合った様々なEPAプローブの合成の可能性が広がった。
そして、cEPAの生理機能解析を行い、細菌において天然型EPAの機能を代替できることを示した。これは、cEPAがEPAの生理機能解析に有用であることを示した結果であり、EPAの挙動解析やEPA修飾タンパク質の探索などの今後の研究につながる成果である。
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| Strategy for Future Research Activity |
EPA生産性細菌において、cEPA含有培地で培養した細菌にアジドビオチンを添加し、銅触媒存在下で化学修飾する。ストレプトアビジンビーズを用いてEPA修飾タンパク質を精製し、トリプシン消化物を質量分析に供することで得られたEPA修飾タンパク質を同定する。生化学的手法により、同定されたcEPA結合型タンパク質の結合様式やタンパク質の EPA修飾の生理的意義について解析する。
局在解析については、cEPA含有培地で培養した菌を化学固定した後、銅触媒存在下でアジド基を持つ蛍光色素（Alexa-488 azide）を修飾し、菌体内におけるcEPAの可視化を試みる。本菌の主要な脂肪酸であるパルミトレイン酸（PAL）のω末端にエチニル基を導入したω-エチニル型PALを合成し、cEPAの挙動と比較することによって解析を進めていく。
また、本手法をガン細胞などの高等生物由来のモデル生物に展開したいと考えている。
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