３次元形態を制御した細胞がしめす走化性誘導因子への応答の違い

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J10080
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 中村 允 東京大学, 総合文化研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: 走化性 / 細胞性粘菌 / 細胞形態 / イメージング / 微小流路

Outline of Annual Research Achievements

走化性運動は細胞一般がしめす基本的な細胞機能であり、走化性誘導因子にむかって細胞が移動する現象である。形態形成過程では特定の細胞を所定の位置へ誘導するのに利用される他、ガン細胞の転移、免疫応答に関与する。走化性運動の理解は重要な課題の１つである。
走化性運動についてのこれまでの研究は主に２次元平面上の細胞を対象にしてきたが、実際の細胞は周囲を他の細胞で囲まれた環境下で走化性運動を行う。近年、周囲を３次元的に囲まれた細胞の走化性運動に、これまでに発見されていない細胞動態や分子メカニズムの存在が示唆された。しかし、実際の細胞集団を対象に解析することは複雑で難解である。
そこで本研究では、走化性運動を分子レベルで解析するのに適した細胞性粘菌を題材に、「細胞の３次元形態」と「走化性誘導因子の刺激」を制御できる微小流路を用い、集団内の環境により近い条件で細胞の走化性運動を解析することにした。
本年度は、細胞の３次元形態を変化させるデバイスとして、凹凸のある足場上の細胞運動について調査を進めた。その結果、F-アクチン波を示す細胞は凹凸を持つ足場に沿った方向に重心移動することがわかった。そこで画像解析を行った結果、F-アクチン波は移動方向の細胞膜を押し広げることで重心移動に関与することを示した。続いてF-アクチン波が足場に加える力(traction force)を計測し、リッジに沿った重心移動への波の寄与を可視化した。加えて、F-アクチン波の伝搬への膜変形の関与を調べるため、BARドメインを含むタンパク質(BARタンパク質)に注目した解析を進めた。F-アクチン波を示す細胞を観察したところ、波の伝搬する膜変形領域にはBARドメインを含むタンパク質が局在していた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

凹凸のある足場上の細胞運動について調査を進めた。主要な進捗を以下に記す。1. F-アクチン波を示す細胞は凹凸を持つ足場に沿った方向に重心移動することを示した。2. F-アクチン波は細胞重心移動へ寄与することを示した。3. F-アクチン波が生み出すtraction forceの計測。4. F-アクチン波の伝搬を制御しうる分子機構の調査(BARタンパク質)。本年度は主に以上の進捗があったが、年度終盤、体調不良により一部の実験を実施できなかった。
1.細胞を乗せる足場に凹凸のあるデバイスとして、幅数マイクロメートルの直線的なリッジが一定の間隔で並んだデバイスを用いた。cAMPへの走化性を示す時期の細胞を観察した結果、細胞はリッジに沿って重心移動した。さらにアクチン分子の分布を可視化したところ、F-アクチンの疎密波(F-アクチン波)がリッジに沿った方向に伝搬する様子が見られた。
2.F-アクチン波の細胞重心移動への関与を検証するため、平面的な足場上の細胞を観察した。画像解析の結果、F-アクチン波は移動方向の細胞膜を押し広げ重心移動に関与することを示した。
3.始めにtraction forceを計測する実験系を確立した。続いて平面的なゲル上のF-アクチン波のtraction forceを計測し、波の前端は足場を細胞側に引き寄せる力を、後端は細胞を前方に押し出す力を生み出すことを示唆した。次にゲル表面に凹凸をパターンとして作成して計測を行い、リッジに沿った方向に伝搬するF-アクチン波の前端がリッジ領域の足場を細胞側に引き寄せる様子を観察した。
4.F-アクチン波の前端は、基質近傍の細胞膜は細胞質側に入り込んだ変形をしており、これが波と共に伝搬することがわかった。そこでF-アクチン波を示す細胞を観察した結果、波の伝搬する膜変形領域にはBARドメインを含むタンパク質が局在していた。

Strategy for Future Research Activity

第3年度目は、「細胞の３次元形態」と「走化性誘導因子の刺激」の条件を変え、流路内の細胞が示す走化性運動の違いについて定性的・定量的に検出する。
第２年度目までの研究により、幅数マイクロメートルの直線的なリッジ上の重心移動にF-アクチン波が機能的役割を担うことがわかった。加えてBARドメインを含むタンパク質の寄与も示唆された。この結果は、リッジパターンにより細胞膜の３次元形態を変化させた細胞が示す特徴的な重心移動モードについて、分子レベルでの理解を与える知見と言える。
今後は、細胞に与える走化性誘導因子の濃度を変えて実験を行う。さらに細胞の３次元形態を変形させるデバイスについても、足場の凹凸の形や、細胞を閉じ込める流路の形を変えたデバイスを複数用意して観察を行う。
特に注目する分子として、細胞性粘菌の走化性運動に重要な寄与をするF-アクチン、Ras、PI3-kinaseに加え、細胞膜の曲率依存的に膜に局在しF-アクチンの膜近傍への集積を促すBARドメインを含むタンパク質などのダイナミクスを解析する。注目分子について、２次元平面上と３次元形態を制御した環境下との間に違いを検出できるか検証する。まずは、BARタンパク質と細胞内F-アクチンの局在変化および膜変形の関連性について分子レベルで調べるため、凹凸を持った足場上の細胞の観察、およびSspB-iLIDの系を用い、細胞膜領域にBARタンパク質をリクルートした際の細胞動態や膜変形の有無を観察する。
最終的に「細胞の３次元形態」と細胞表面に対する「走化性誘導因子の刺激」の違いが走化性運動におよぼす影響を分子レベルで明らかにし、新たに発見した細胞動態や分子メカニズムについてまとめ報告する。