2016 Fiscal Year Annual Research Report
口腔バイオフィルム初期定着菌群による歯周病の個体差別予防モデルの構築
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15J30007
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
眞島 いづみ 北海道医療大学, 歯学部, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | Streptococcus属 / Veillonella属 / メタゲノム解析 / 全ゲノム解析 / Autoinducer-2 / Cyclo-Leu-Pro |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではStreptococcus(ストレプトコッカス)属細菌とVeillonella(ベイオネラ)属細菌を用いて、歯周病を代表とした口腔感染症の個体差別予防モデルの構築を目的として研究を進めている。
平成28年度は、Veillonella tobetsuensis(V. tobetsuensis)が産生する細菌間情報伝達物質、Autoinducer(AI)-1、AI-2、及びCyclo-Leu-Proの産生に関与するコード遺伝子を検索するに当たり、その比較対象となる口腔Veillonella全7菌種の全ゲノム解析を開始した。更に、V. tobetsuensis由来のAI-2及びCyclo-Leu-Proを用いて、代表的口腔バイオフィルム形成開始菌であるStreptococcus gordonii (S. gordonii)に対する影響を解析したところ、いずれもそのバイオフィルム形成を有意に抑制したが、プランクトニック細胞の増殖には影響を与えなかった。これらの結果から、V. tobetsuensis由来AI-2及びCyclo-Leu-Proは、S. gordoniiのバイオフィルム形成に抑制的に働きかけ、その増殖因子は別に存在することが明らかになった。
更に、Streptococcus属とVeillonella属細菌が定着しやすい個体条件の選定を進めるため、その第一段階として、健康なヒト90名の唾液を採取し、そのメタゲノム解析を行った。その結果、口腔清掃状態が悪化するにつれて、Streptococcus属の割合は減少し、Veillonella属の割合が有意に増加することが明らかになった。
これらの研究成果により、Veillonella属細菌が口腔感染症の予防、診断及び治療の指標として応用できる可能性が強く示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画に基づき、以下1.～5.を遂行中である。 1．口腔Veillonella全7菌種の全ゲノム解析を継続中である。 2．上記研究実績概要より、V. tobetsuensis由来AI-2及びCyclo-Leu-Proの両物質が歯周病を代表とした、口腔バイオフィルムによる感染症の予防に応用できることが期待できる。そのAI-2が、S. gordoniiのバイオフィルム形成に与える影響の解析結果に関してはJournal of Oral Biosciencesに受理され、Cyclo-Leu-Proの研究成果に関しては現在投稿準備中である。 3．上記1．の結果から関連遺伝子を特定し、その欠損株を作製する。そのために、昨年度から継続してCRISPR/Cas9及びCpf1システムを用い、口腔細菌では初の試みとなるゲノム編集技術確立に向けて、諸条件を検討中である。また、表現型欠損株作製のコントロールとして、V. tobetsuensisと同じ口腔偏性嫌気性菌であるP. gingivalisを追加した。 4．上記研究実績概要のメタゲノム解析結果より、Veillonella属細菌が口腔感染症予防、診断の指標として応用できることが示唆され、その成果は現在、PLoS ONEに投稿中である。 5．上記のヒト唾液のメタゲノム解析の他に、rpoB遺伝子の塩基配列を応用して口腔Veillonella属菌種特異的プライマーセットを開発した。その結果はOne-step PCR法として、平成28年度にPLoS ONEで公表した。更にそれを用いて、同唾液サンプル中のVeillonella属の分布と出現頻度を菌種レベルで解析した。その成果は、現在Anaerobeに投稿中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在Veillonella属の新菌種として登録を進めている一菌種を含め、口腔Veillonella全7菌種の全ゲノムを次世代シークエンサーを用いて解析する。その後アセンブリとアノテーションの付与を行い、全ゲノムデータをGenbankに登録することで、口腔Veillonellaのゲノムデータベースを確立すると同時に、新菌種のゲノム情報をGenome Announcementsに報告する。また、これら7菌種の比較ゲノム解析を行い、各遺伝子セットから代謝経路を解析することで、V. tobetsuensis由来AI-1, -2, Cyclo-Leu-Pro産生関連遺伝子の特定を行う。その結果から、欠損株の作製を行い、S. gordoniiのバイオフィルムに対する影響を解析する。
一方、Streptococcus属とVeillonella属細菌が定着しやすい個体条件の選定を更に進めるため、国及び地域別、食生活の違いによる唾液試料を採取し、その細菌叢の解析を行う。また、平成28年度に採取した唾液サンプルから、既報の菌種には分類されない複数の未同定株が分離されたため、これら分離株をVeillonella属新菌種として提唱する準備を同時に進める。
上記の解析後、研究計画に則り、Streptococcus属とVeillonella属細菌が口腔内に定着しやすい個体群より再度唾液を採取して、両属細菌が口腔内に定着しやすい遺伝子（群）の特定を進める。本解析にはゲノムSNPsとの関連解析（GWAS: Genome Wide Association Study）を用いる予定である。
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