2018 Fiscal Year Research-status Report
骨格筋への多価陽イオン投与による廃用性筋萎縮予防法開発のための基礎的研究
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15K01401
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| Research Institution | Kansai University of Welfare Sciences |
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Principal Investigator |
森 禎章 関西福祉科学大学, 保健医療学部, 教授 (70268192)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山路 純子 (田代純子) 関西福祉科学大学, 健康福祉学部, 准教授 (40340559)
廣島 玲子 関西福祉科学大学, 保健医療学部, 准教授 (40404777)
宮崎 彩子 兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (20298772)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ミオシン重鎖タイプI / インターロイキン-6 / カルシニューリン / 多価陽イオン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
廃用性筋萎縮においては骨格筋において遅筋を構成するタイプI線維が著明に減少することが知られている。タイプI線維には収縮蛋白としてミオシン重鎖タイプI (MyHC I)が存在しており、この収縮蛋白を何らかの方法で増加させることが廃用性筋萎縮を予防するための効率的な手段となる。近年、運動負荷による低酸素やグルコース欠乏により骨格筋細胞から分泌されるインターロイキン-6（IL-6）が注目を集め、数々の研究が行われているが、細胞内Ca2+濃度上昇により脱リン酸化酵素であるカルシニューリンが活性化すると転写因子であるNFATが活性化され、IL-6が骨格筋細胞において産生される。IL-6が骨格筋細胞において産生されると、オートクライン・パラクラインにより骨格筋細胞自身の作用し、MAPキナーゼ系の情報伝達システムを介して収縮蛋白を増加させることが明らかとなっている。我々は、培養骨格筋細胞を用いてカルシニューリンを活性化させることで収縮蛋白が増加するかを分子生物学的手法により検討し、カルシニューリン活性化剤であるクロロゲン酸や不飽和脂肪酸等がカルシニューリン活性化を介してIL-6の産生を増加させ、MyHC I mRNA発現量を増加させることを明らかにした。同時に、培養骨格筋細胞へのLa3+、Gd2+、Ni2+等の多価イオン投与が、細胞内においてCa2+非依存性にカルシニューリンを活性化させ、MyHC I mRNA発現量を増加させることを明らかにしている。この結果を踏まえ、これらの多価イオンの細胞内への流入経路を検討するためにパッチ・クランプ実験装置を構築し、ホール・セル記録による細胞膜電流の測定を行うべく基礎実験を行うとともに、実験装置の改良ならびにデータ取得を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
これまで、購入した倒立顕微鏡に設置する既存のマニピュレーターを新しい顕微鏡に取り付けるためのアダプタの作成等を特注にて行った。しかし、新しい顕微鏡に取り付けるアダプタの位置調整に手間取り、一旦作成されたアダプタの改修作業等が遅延したため実験の進捗が遅延した。本年度にはアダプタの作成とマニピュレータの取り付けが完了してパッチ・クランプ装置の機械的部分がほぼ完成を迎え、C2C12細胞を用いたパッチ・クランプ実験に向けて鋭意努力している。現在は、ホール・セル記録法による全細胞電流を観察できる状態に到達したが、実験室の電気的な環境に問題があり、量的に多いK+などのイオンを観察する場合には問題が少ないものの、低濃度のイオン電流を測定するには電流ノイズが多いため、本格的なホール・セル実験を行えていない状況である。このため、実験室の移動等の環境改善を含めてさらなる装置の改良が必要であり、進捗状況としては遅延している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、最初にパッチ・クランプ実験装置のノイズ低減を行い、微量のイオンを用いたホール・セル記録が行えるようにする。まず、電源よりのノイズ流入遮断のための電源アイソレーション、さらには外部よりの電磁波ノイズ流入を防ぐためのファラデーケージのを含む実験台の再構築を行い、微量のイオンを用いたホール・セル電流を記録できる環境を再構築する。この上で、C2C12細胞を用いたパッチ・クランプ法のホール・セル記録法により、La3+電流、Gd3+電流、Ni2+電流の記録をおこなう。電極内液の組成は2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、120 mM NaCl、10 mM HEPES、11 mM EGTA、4 mM Mg-ATP、細胞外液の組成は2 mM CaCl2、135 mM NMDG-Cl、10 mM HEPES、10 mM Glucoseとし、細胞外液に300 uMのLa3+、Gd3+、もしくはNi2+を添加し、-90 mVから+90 mVまで15 mVステップの電圧固定を行うことで、ホール・セル電流が増加することを観察する。 これらの多価陽イオンの投与によりホール・セル電流が増加した場合には、チャネル阻害剤を投与し、ホール・セル電流の変化を観察する。
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| Causes of Carryover |
本年度は、マニピュレーター取り付けアダプタが完成し、パッチ・クランプ装置が一応の完成を迎えた。しかし、微量のイオンについてのホール・セル電流を測定するためには電気的ノイズが過大なため、本年度この問題を解決する必要がある、このため、実験装置の改良を行った上で本年度遂行できなかったパッチ・クランプ法による多価イオン投与によるホール・セル電流測定実験を行う。このため、パッチ・クランプ実験装置の実験機器改良費として200000円、試薬、培養液等の購入費として300000円、成果発表費用として143063円を用いる。
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