SNAP-25のリン酸化とストレス障害の関係性の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K06778
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 山森 早織 北里大学, 医学部, 講師 (30464803)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: リン酸化 / ストレス / シナプス / 副腎 / SNAREタンパク質 / SNAP-25 / 開口放出

Outline of Annual Research Achievements

SNAP-25は開口放出にかかわるSNAREタンパク質の一種である。拘束浸水ストレスを加えると脳内でSNAP-25はリン酸化され、遺伝子操作でSNAP-25のリン酸化を消失させたマウスは、扁桃体でのモノアミン放出の低下、不安行動、てんかん発作を示す。本研究ではストレスと脳や副腎のSNAP-25のリン酸化の関係を明らかにすることを目的にしている。
本年度は、免疫組織化学によるリン酸化SNAP-25の検出に成功し、脳領域の変化の詳細な解析が可能となった。SNAP-25は脳の全域に存在するが、野生型マウスに拘束浸水ストレスを与えた際にリン酸化が大きく亢進する部位は、辺縁系を中心する限られた領域であり、この経路を連絡する神経線維で特に強いことを明らかにした。この結果は、脳の領域ごとの摘出や細胞分画で得られたサンプルを用いた抗リン酸化SNAP-25抗体によるイムノブロットの結果とも矛盾しなかった。さらに、SNAP-25のリン酸化は麻酔薬によっても生じ、処理時間に応じてシグナルは強く広範囲まで広がり、また数分で麻酔から覚醒が起こるのと同時にSNAP-25のリン酸化も直ちに消失することを明らかにした。
一方で、副腎のSNAP-25のリン酸化とストレスの関係性は見えていない。まず、リン酸化SNAP-25は、ストレスを受けたマウスの副腎やリン酸化を亢進させる薬剤処理をした培養副腎細胞においてもイムノブロットによって検出されてこない。SNAP-25の発現量は脳に比べて低いが、そのリン酸化割合も低いものと考えられた。そして、SNAP-25のリン酸化が生じない変異マウスと野生型マウスに拘束浸水ストレスを与えると、血中CORT（副腎皮質が分泌）は両マウスとも同程度上昇し、血中アドレナリン（SNAP-25を発現する副腎髄質が分泌）は両マウスとも上昇を示していない。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は免疫組織化学によるリン酸化SNAP-25の検出法の確立に成功し、新たな抗体も作成した。これにより、SNAP-25のリン酸化の変化について、空間的な情報を得ることが可能になり、注目すべき神経回路をしぼることが出来た。麻酔薬や各種のリガンドの阻害剤を投与し、SNAP-25のリン酸化の変化をイムノブロットと免疫組織化学により調査した結果、麻酔薬によりSNAP-25のリン酸化が亢進することを明らかにした。いくつかの阻害薬でも変化する可能性が見いだされており、さらなる検討を行う予定である。
また、各種の慢性ストレスの種類の検討においても興味深い結果を得た。慢性ストレスの１つとして個別飼育の影響を、各週齢の野生型マウスとSNAP-25のリン酸化が生じない変異マウスで調査した。変異マウスについては、摂食リズムは個別飼育と群れ飼育（対照群）でどちらも変動を示しつつも拒食は示さなかった。また野生型マウス、変異マウスともに、血中CORT濃度に特徴的な変化はなかった。しかし、野生型マウス脳内のリン酸化SNAP-25量は個別飼育の期間内での変動は検出されないが、群れ飼育と比べ個別飼育を体験した野生型マウスでは拘束浸水ストレスによるSNAP-25のリン酸化の上昇程度が低くなる可能性が見いだされた。また、別の慢性ストレスとして拘束浸水ストレスを毎日与えると、野生型マウスではストレスを与える回数が増えるにしたがってSNAP-25のリン酸化の上昇が生じにくくなる可能性も見いだされた。
副腎でのSNAP-25のリン酸化の役割については、研究概要に示すように予想外の結果が生じたために検討項目を追加して研究計画の見直しを行い、変異マウスの培養副腎を用いたアドレナリン放出実験を見合わせた。

Strategy for Future Research Activity

当初利用を考えたSNAP-25のリン酸化が生じない変異マウスでの「代謝ケージで拒食を生じる現象」と「慢性的なチューブ拘束により血中CORT放出の増加が起こりにくくなる現象」の再現性が低下している。またこれらの慢性ストレス下で野生型マウスの脳内のSNAP-25の変動は検出されなかったため、SNAP-25のリン酸化を介したストレス耐性の発現に関わるシグナルを調査することが難しくなっている。新たに、野生型マウスが慢性ストレスを経験すると急性ストレスに対するSNAP-25のリン酸化反応を変化させる可能性を見いだしたため、この現象を利用したアプローチへと変更することとした。野生型マウスのストレス経験の有無による急性ストレスに対する脳内シグナルの変化をまず探り、次いでSNAP-25のリン酸化が生じない変異マウスとの比較により、慢性ストレスに対する脳内シグナル、血液、体重、行動の変化の違いを探し、ストレス適応あるいはストレス障害の機序を探る予定である。
また引き続き、野生型マウスに各種リガンドの阻害剤や活性化剤などを投与し、脳内のSNAP-25のリン酸化の変化と、関わる分子の変化を調査する。さらに、効果のあった薬剤の長期的な影響や、変異マウスでの反応に違いがないか調査を行う。
さらに本年度開発したSNAP-25リン酸化抗体の免疫組織化学染色には、グルタール固定が適さないため、免疫電顕による微細構造の解析が難しい。また、マウスの副腎におけるSNAP-25のリン酸化の検出が困難となっている。そのため、脳や副腎の培養細胞を用いたリン酸化SNAP-25の動態観察に取り組む予定である。

Causes of Carryover

次年度に合わせて利用した方が有効利用できるため、5万円ほどを繰り越した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

凍結受精卵の融解移植や抗体の購入の一部にあてる。