モデル生物ゼニゴケにおけるマイクロインジェクションを用いたゲノム編集技術の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K06902
• Research Institution: Kinki University
• Principal Investigator: 大和 勝幸 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (50293915)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: マイクロインジェクション / ゲノム編集 / ゼニゴケ

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，植物科学および生殖科学における日本発の新しいモデル生物として注目されているゼニゴケを用いた遺伝子機能解析を促進するため，CRISPR/Cas9のマイクロインジェクションによるゲノム編集法の開発を目指す。
まず，マイクロインジェクションに適した細胞を得るための条件を検討した。分化能および数量という点では胞子，あるいは発生が始まって間もない胞子由来の細胞が最適と考えた。ゼニゴケ胞子を偏光青色光下で培養すると，１細胞からなる原糸体が光の振動面に対して垂直な方向へと先端成長する。この時，伸長する原糸体先端部周辺の細胞壁は比較的薄いと考えられ，実際に穿刺しやすいことが判明した。次に，上記の細胞を用いてマイクロインジェクションを実施する際に用いるニードル形状およびインジェクション操作を最適化した。インジェクション操作の基本的な項目である①ニードルの形状（主に先端径），②穿刺操作（細胞支持体の材質および形状，ニードルのアプローチ方向など），③穿刺部位および穿刺深度についてはほぼ確立できたと考える。
現段階では，マイクロインジェクションのモニターにはFITC-デキストランを使用している。マイクロインジェクションにより，細胞質内への液体の注入はほぼ確実に行えるようになったが，穿刺後に生存できないという問題が明らかになった。穿刺後の生存率を上昇させる条件を検討したところ，光の遮断およびある種の細胞膜保護作用をもつ物質の添加が有効であることが判明した。現在穿刺後の生存率を挙げるために，穿刺後の培養条件を最適化している。
アグロバクテリウム法でガイドRNA遺伝子およびCas9遺伝子を導入する方法により，代謝遺伝子およびメチル化関連遺伝子の改変に成功した。前者については機能喪失による表現型が観察されたが，後者についてはゲノム配列に変化が見られたものの，明らかな表現型は観察されなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

マイクロインジェクション後の細胞が死滅するという問題が生じたため，mRNA注入などの実験を実施できなかった。

Strategy for Future Research Activity

マイクロインジェクション後の細胞が死滅するという問題が生じたが，マイクロインジェクション操作そのものは確立できている。また，マイクロインジェクション後の回復培養法も確立しつつあるので，mRNA等の注入実験に移行する。

Causes of Carryover

本年度はマイクロインジェクション後の細胞の生存率の改善を優先的に実施し，次世代シーケンサによる解析を実施しなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本年度に研究代表者が作成したゲノム編集株の解析を実施するための解析費用として使用する。