2015 Fiscal Year Research-status Report
1分子解析技術による真核生物のＤＮＡ複製反応解析へのアプローチ
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15K06946
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
大重 真彦 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (00451716)
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| Project Period (FY) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| Keywords | １分子観察 / 分子計測 / 分子操作 / 可視化技術 / 酵素反応 / DNA複製 / DNAポリメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
交付決定が10月だったため、実施期間が半年間で行うことが可能な実験として蛍光タンパク質の調製およびDNA操作実験を実施した。
【各種DNA代謝酵素の蛍光標識法の確立】
DNA複製因子の性質に応じた蛍光標識法を確立した。方法として、黄色蛍光タンパク質（YFP）等の蛍光タンパク質との融合タンパク質発現系を構築した。PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)-YFP、PCNA-DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein)、SSB(single-strand binding protein)-DsRedの大腸菌用発現ベクターを構築し、可溶性もしくは活性のある蛍光タンパク質を得ることに成功した。DNAポリメラーゼβ-YFP・DNAポリメラーゼλ-YFPについては、DNAポリメラーゼβ・DNAポリメラーゼλ単独の活性よりも非常に弱いため化学修飾による蛍光標識法を検討した。その結果、DNAポリメラーゼβについては蛍光標識が可能であり、DNA合成活性についても問題はなかった。この方法を用いることにより、DNAポリメラーゼλやDNAポリメラーゼδでも蛍光標識が可能かどうか検討を開始した。また、Replication factor Cを構成する５種類のタンパク質の調製法を確立した。
【鋳型DNAへの超らせん導入技術】
DNA複製因子の１分子解析を行うためのDNA分子操作技術を確立した。λDNAの片端をガラス基板に固定、もう一方のλDNAの端に磁気ビーズを固定し、磁力を用いることによりDNAに正負の超らせんを導入し、超らせん密度を制御することが可能であることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
蛍光タンパク質の調製方法を確立し、観察に必要な蛍光タンパク質の調製に成功した。また、蛍光タンパク質の挙動解析を行うためのDNAの分子操作技術も確立し、１分子観察を行うための実験環境を整えることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNAポリメラーゼの蛍光標識法については、YFP等の蛍光タンパク質との融合タンパク質では、活性が阻害されることを確認した。そのため、DNA結合部位や活性部位をDNAや基質で保護し、タンパク質表面のアミノ基（Lys残基）と蛍光化合物との架橋法について検討していく。この方法は、DNAポリメラーゼβでは可能であることを確認したが、DNAポリメラーゼλやDNAポリメラーゼδでも可能であるか確認を行う。
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| Causes of Carryover |
実験計画立時は４月開始の研究計画を立案していたが、本研究の内定通知は10月であった。そのため、前年度行う予定であった詳細な観察・計測実験を次年度に先送りし、観察・計測に必要な蛍光タンパク質の調製およびDNA操作技術の開発を中心に行ったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
蛍光タンパク質の調製およびDNA操作技術の開発は順調に進展し、次年度に観察・計測実験を中心に行うことが可能な環境が整った。そのため、今年度の観察実験を行うための予算を次年度に執行する。
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[Presentation] Direct single-molecule observations of DNA synthesis and digestion reactions.2015
Author(s)
Shunsuke Takahashi, Shohei Kawasaki, Hirofumi Kurita, Takeshi Mizuno, Shun-ichi Matsuura, Akira Mizuno, Masahiko Oshige, Shinji Katsura
Organizer
The 11th International Workshop on Radiation Effects on Semiconductor Devices for Space Applications (11th RASEDA) and The 7th International Conference on Advanced Micro-Device Engineering (7th AMDE)
Place of Presentation
桐生市市民文化会館（群馬県・桐生市）
Year and Date
2015-11-12
Int'l Joint Research
