2015 Fiscal Year Research-status Report

コアプロモーター認識因子の選択によるmRNA運命決定機構の解明

Research Project

Project/Area Number	15K06953
Research Institution	Yokohama City University
Principal Investigator	古久保哲朗横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (10271587)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	転写調節 / 転写因子 / 局所翻訳制御 / SAGA / TFIID / TAF / TBP / 出芽酵母
Outline of Annual Research Achievements	基本転写因子TFIIDはTBPと14種類のTAFから構成される巨大な複合体であり、SAGAとともにコアプロモーター上で働き、TBP-DNA相互作用を制御することによって転写の活性化を行う。最近我々は、同一のプロモーターからTFIIDまたはSAGAによって転写されるCLN2 mRNA（以下CLN2 mRNA[TFIID] or [SAGA]）が機能の異なる二種類のCln2pに翻訳される可能性を示した。またCLN2 mRNA[SAGA]は、RNA結合タンパク質の一種であるSsd1p依存的に転写され、分解から保護されるとともに、RAMシグナル経路による局所翻訳制御を受けることを示唆する結果を得た。昨年度までに、①TFIID内部のTBP活性制御領域であるTANDの欠失変異（taf1-deltaTAND）がRAMシグナル経路の各種変異に対して特異的な合成致死性を示すこと、②Ssd1p依存的に分解から保護される安定化型のCLN2 mRNA[SAGA]量がtaf1-deltaTAND株において有意に増加すること、またRAMシグナル経路の最終エフェクターキナーゼであるCbk1pの活性を自在に制御し得るcbk1-as2株を作製し、③1-NA-PP1（Cbk1p[as2]に対する特異的な阻害剤）存在下において安定化型のCLN2 mRNA[SAGA]量が顕著に増加すること等を明らかにした。さらに今年度は、①cbk1-as2 taf1-deltaTAND二重変異株の生育が1-NA-PP1に対して感受性を示すこと（上記合成致死性のchemical mimicryの確認）、②Cbk1p阻害によるCLN2 mRNA[SAGA]量の増加はTAND依存的な負のfeedback制御を受けることを見出した。以上の結果は、上記合成致死性の分子基盤を説明し得るものであり、大変興味深い。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason CLN2転写におけるTAND依存的な負のfeedback制御を新たに発見したこと、ならびにTAND欠失変異とRAM欠損変異間の特異的な合成致死性を分子レベルで説明し得る可能性を見出したことなどから。
Strategy for Future Research Activity	CLN2 mRNA上に存在すると考えられるSsd1p and/or Mpt5p認識配列の決定を行うとともに、immobilized template assay法によりPCIDドメインとRNBドメインの役割分担について調べる。さらにm-TAG法を用いてCLN2 mRNA[TFIID]及びCLN2 mRNA[SAGA]の細胞内局在を調べ、Cln2pが有する二種類の機能との連関について新たな知見を得る。
Causes of Carryover	TAND欠失変異とRAM欠損変異間の合成致死性の原因として当初考えていた分子モデルが必ずしも正しくないことが判明し、計画の変更が必要となったため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	新たな分子モデルの検証に取り組むとともに、CLN2 mRNA[TFIID]及びCLN2 mRNA[SAGA]の細胞内局在と、Cln2pが有する二種類の機能との連関については、当初の計画通り解析を進める。