セントロメアを染色体上の一カ所に調節する機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K06958
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 佐藤 浩 九州大学, 歯学研究院, 助教 (00421313)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: セントロメア / ヒストン / エピジェネティクス / 染色体

Outline of Annual Research Achievements

染色体分配に必須であるセントロメアは、エピジェネティックな機構により可塑的にその形成が制御される。本申請研究はモデル生物である分裂酵母を用いて、このセントロメアがどのようにして染色体上の一カ所に調節されているか明らかにするために、その分子機構の解明を行っています。申請者はこれまでの研究において、2本の染色体を融合し、一方のセントロメアが不活性化することにより安定化するシュードダイセントリック染色体を保持する株を確立しており、このセントロメアの不活性化にはヘテロクロマチンやヒストンの脱アセチル化が関与している事を示していました。しかしながら、さらなるセントロメア不活性化因子の存在が示唆され、それにはクロマチンの構造や修飾状態が重要であると考えました。そこで、昨年度に、ヒストンH3およびH4の報告されている複数カ所のアミノ酸に対するメチル化、アセチル化、リン酸化等に対する抗体を用いた免疫沈降実験を行い、活性と不活性化のセントロメア間の比較を行うことにより、不活性化セントロメアにおいて特異的に増加、もしくは減少が見られるヒストン修飾を検出しました。このうちヒストンH4の20番目のリジンのメチル化(H4K20me1)は、活性のあるセントロメアで顕著に検出され不活性なセントロメアにおいてはほとんど検出されませんでした。この結果はヒトやチキンにおいて報告されているセントロメアの形成へのH4K20me1の重要性と一致します。しかし、シュードダイセントリック染色体株で、このメチル化に関わる遺伝子を操作しメチル化を誘導もしくは欠失させても、セントロメア活性や細胞の分裂に大きな変化は見られませんでした。一方で、この修飾はセントロメア領域におけるヘテロクロマチンと関連して大きく変化を示したことから、分裂酵母のセントロメアにおけるH4K20のメチル化のさらなる機能解析を現在行っています。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成２７年度に、セントロメアの活性抑制の直接的な機構を明らかとする目的で、不活性化セントロメアのクロマチン構造解明のため、ヒストンの修飾状態をクロマチン免疫沈降法によって解析しました。その結果、不活性化セントロメアに特徴的ないくつかのヒストン修飾が明らかとなりました。
平成２８年度はこの修飾の機能を解明するために、関連する酵素の過剰発現や遺伝子破壊を用いて解析を行いました。現在のところ、セントロメアの活性の抑制に直結するような遺伝子の同定には至っておりませんが、ヒストンH４の２０番目のリジンのメチル化を始めとして、いくつかのヒストン修飾について、分子生物学的な手法を用いて解析を行っており、研究計画はおおむね遂行できていると考えています。今後、並行して遺伝子破壊株を用いたセントロメア数認識に関わる分子とその調節機構の解明を行う事を計画しています。

Strategy for Future Research Activity

平成２７年度において、本研究の目的である「セントロメアを染色体上の一カ所に調節する機構の解明」のための手段として、不活性化セントロメアにみられる特異的なヒストン修飾の変化を明らかとした。そして平成２８年度はこの結果をもとに、このヒストン修飾の意味・役割を明らかにするため、修飾に関わる酵素の高発現や遺伝子破壊を行うことにより、シュードダイセントリック染色体の二つのセントロメアの動態（不活性化セントロメアの再活性化や活性化セントロメアの不安定化、セントロメア活性のスイッチング）や染色体自体の挙動の解析を行った。
今後の研究の推進方策としては、現在行っているH4K20meの解析に加えて、その他の不活性化セントロメア特異的なヒストン修飾についても、メチル化酵素や脱メチル化酵素などの修飾に関わる酵素の過剰発現や遺伝子破壊により、セントロメアや染色体の挙動を明らかにし、その機能の解析を続ける。これによって、セントロメア活性を直接的に抑制する機構の解明を行う。またセントロメアの再活性化抑制に関与することが示唆されるヘテロクロマチンの変異株のバックグラウンドにおける同様の解析や、ヒストン修飾をミミックするようなヒストンの発現株における解析も行う。
さらに、ヒストンシャペロンやDNA損傷チェックポイントタンパク質などに関わる遺伝子の破壊を行い、ダイセントリック染色体の変化を観察することで、セントロメア数の認識調節経路の解明を行うことで、研究目的の達成を計画している。

Causes of Carryover

研究のまとまり具合や時期の適切さなどから、本年度は学会や論文において研究成果の発表の機会が得られなかったため、その分の計上していた予算が次年度繰越額（使用額）として生じました。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成２９年度に行う、セントロメア数の認識調節機構の解析に関わる遺伝子の破壊や過剰発現実験のための、酵素やオリゴDNA、試薬などの消耗品の購入と、研究成果を学会で発表するための旅費、論文として発表するための費用としての使用を計画しております。