2016 Fiscal Year Research-status Report
チロシンキナーゼ-阻害剤間相互作用の速度論的解析に基づく抗がん剤耐性機構の解明
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15K06978
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
小橋川 敬博 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (90455600)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森岡 弘志 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (20230097)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | チロシンキナーゼ / 阻害剤 / 耐性変異体 / 相互作用 / ゲートキーパー変異体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
受容体型チロシンキナーゼの1種であるFGFR1は種々のがんに関わっており、重要な創薬標的となっている。本研究課題ではFGFR1のがん変異体、その中でも特に抗がん剤耐性変異体に着目し、阻害剤との相互作用の物理化学的解析に基づき、阻害剤耐性機構の解明を目指している。昨年度までに、N546K変異体の阻害剤耐性機構を明らかにした。本年度はV561M変異体に耐性機構の解明を目指して解析を行った。その結果、PD173074に対する親和性が顕著に低下していた。V561Mはグリシンリッチループの構造が活性型に偏っていることをNMRにより明らかにしていた。このグリシンリッチループ周辺が、PD173074のtert-Butylとの間に立体障害を生じている可能性が示唆された。PD173074と同様にdimethoxy-phenylを有するBGJ-398についても検討を行った。BGJ-398はグリシンリッチループ周辺とは相互作用しておらず、この領域の構造が活性型に偏っても立体障害は生じない。その結果、BGJ-398はPD173074に比べてV561Mに対して顕著に高い親和性を示した。V561周辺の立体障害だけがPD173074に対する親和性低下の要因ではないことを確認するために、V561I変異体についても検討を行った。この変異体はNMRの結果よりグリシンリッチループが不活性型構造に偏っていることが示されている変異体である。その結果、PD173064に対する親和性がV561Mに比べて顕著に高かった。以上より、V561M変異体が変異部位近傍の立体障害だけがPD173074に対する耐性の要因ではなく、変異に伴いグリシンリッチループの構造平衡状態が変化し、これにより生じた立体障害も関与することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概ね順調に推進していると言える。本年度はV561M変異体のDP173074に対する耐性機構を明らかにした。H27年度に等温滴定熱量測定 (ITC) によりFGFR1と薬剤の相互作用を評価することを試みたが、薬剤の溶解性のために一旦断念した。しかし、溶液条件の検討により測定を開始できる状況となった。速度論的解析についても、表面プラズモン共鳴法による条件検討を進めていたが、難航していた。そこで、ストップトフロー蛍光を用いた速度論的解析についても検討を始め、測定を開始できる状況となった。平成28年度は年度開始直後に熊本地震に見舞われ、機器の損壊、復旧作業、余震等により、4月と5月の2ヶ月間が本格的に研究を行える状況ではなかった。しかし、その後は外部の研究機器も利用させてもらいながら、なんとか立て直して当初の計画通りに進めることができた。以上の理由により、概ね順調に推進していると言えよう。
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| Strategy for Future Research Activity |
V561M変異体の PD173074に対する耐性機構は明らかになったが、Ponatinib、Dovitinibに対する耐性機構については依然として不明である。平成28年度に行ったITCおよびストップトフロー蛍光の条件検討の過程において、V561M変異体と野生型の間に相違があることを示唆する予備的な知見が得られている。さらなる測定および解析を進めていきたい。加えて、阻害剤結合による動的構造平衡状態への影響についてもNMRにより解析を行い、熱力学的情報、速度論的情報、動的構造状態に関する情報から総合的に阻害剤耐性変異体において何が起こっていて、それがどのようにして阻害剤耐性に関わるかについて明らかにしていきたい。
SPRによる解析に向けて、GSTとFGFR1を別々に発現・調製を行い、その後Protein Ligationの手法により連結することでGST融合FGFR1を得ることを試みていたが、十分な濃度・収量の試料を得ることが困難であり、SPRによる予備的検討しか行うことができなかった。キナーゼの発現で問題となる点の一つは、発現誘導前のリークである。特に、GSTはダイマーであるためGSTにキナーゼを連結した際には、少しでも発現のリークが起こると、自己リン酸化により活性化され、強い比活性を示してしまう。他のキナーゼにおける検討から、発現のリークを抑える上で、形質転換の際の温度条件を最適化することが有効であるとの知見を得ている。そこで、同様の方法によりGST融合状態でのFGFR1の発現を行い、SPRの解析に十分な量の試料の取得を試みる。十分な量の試料が得られれば、速度論的解析および熱力学的解析を行いたい。特に、ストップトフロー蛍光の不感時間内 (100ms程度)に起こる速い反応過程についての知見を得たい。
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| Causes of Carryover |
本年度は3488円を次年度に繰り越した。少額であり、繰り越しによる研究への影響はなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰り越しは少額であり、研究計画への影響はほとんどない。
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