2016 Fiscal Year Research-status Report
共生菌である根粒菌における３型分泌系の機能発現機構
| Project/Area Number |
15K07003
|
|---|
| Research Institution | Nara Women's University |
|---|
Principal Investigator |
佐伯 和彦 奈良女子大学, 自然科学系, 教授 (40201511)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 根粒共生 / 転写因子 / 菌体外分泌装置 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、第１に、根粒菌３型分泌系の転写因子TtsIについて結合配列を精密に同定して、関連する遺伝子候補を探索した後、破壊株作製と相補実験により発現機構の解明を目指している。このために、ttsI欠失株の３型分泌系転写誘導を相補するhexa-His付加TtsIを根粒菌内で発現させて、ホルムアルデヒドによる架橋後、NiゲルによりTtsI-DNA架橋物を精製して、配列解析に供した。現時点では、明確なコンセンサス配列が得られておらず、非特異的結合を抑える必要が有ると判断された。候補遺伝子の同定された場合に備え、並行して、根粒菌ゲノムのマーカーレス部分欠失法の改良を行った。第２に、分泌活性の迅速かつ高感度な測定系の構築により分泌制御機構の解明を目指している。このために、レポータータンパク質としてトゲオキヒオドシエビ由来の単量体ルシフェラーゼをタンパク質工学的に改良したNlucを用い、分泌シグナルとして菌体外放出が確認されているlocus-tag mlr6358のアミノ末端部分を用い、融合遺伝子をミヤコグサ根粒菌ゲノムに組み込んだ株とプラスミドとして保持させる株を構築した。ミヤコグサの宿主側一次シグナルが未同定であるため、西洋ミヤコグサ種子の水抽出物を誘導物として根粒菌培養液に添加後、菌体および細胞外上清に分離して、ルシフェラーゼ活性を測定した結果、mlr6358’-nlucは転写、翻訳され菌体外へ出ていると判断された。しかし、菌体内にも高いルシフェラーゼ活性が認められたため、現在、T3SS欠損変異体の根粒菌および分泌シグナルを付加しないNlucをコントロールとして分泌確認実験を行いつつある。また、ゲノム配列決定済の国内株MAFF303099に加えて岩手県内で採取されたTono株のゲノム決定を行い、同株にも３型分泌系遺伝子群の存在することを確認した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度に検討した誘導および架橋条件では、hexa-His付加TtsIとミヤコグサ根粒菌ゲノムDNAとの結合の特異性は十分に高いものとは言えず、当初の到達目的に達していない。原因として、1) TtsIの外来プロモーターによる発現が大過剰であった、2) ホルムアルデヒド処理条件を制御できていなかった、3) hexa-His付加が結合特異性に影響を与えた、等の原因が考えられる。いずれも、1) プロモーター強度を中ないしは低強度に変更する、2) 短時間且つ温和な架橋条件を検討する、3) 他の分子タグあるいはTtsI抗体を用いたChIPへ実験系を変更する、などにより対応予定である。また、西洋ミヤコグサ種子水抽出物を用いたmlr6358’-nlucの発現実験でも、非誘導時の背景活性が高いことから、実験条件の検討に労力と時間を要している。ただし、ミヤコグサ根粒菌としは類縁度の低い16S rRNA配列を持つ国内株Tonoにも３型分泌系遺伝子群の全セットが含まれていることを確認できた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度に引き続き、根粒菌3 型分泌系に関し、1) 転写制御のcis および trans因子の解析と、2) Nlucルシフェラーゼをレポーター遺伝子とする分泌活性測定系による分泌シグナルの同定を進める。hexa-His付加TtsIとゲノムDNAとの結合検出については、上述の様にやや遅れているが、プロモーター強度や架橋条件自体の改善により、解決を図る。また、西洋ミヤコグサ種子水抽出物を用いたmlr6358’-nlucの発現実験での背景活性が高いことに関しては、概要に記載の通り、T3SS欠損変異体の根粒菌および分泌シグナルを付加しないNlucをコントロールとして改善しつつあるとともに、NlucのC末端に回収濃縮用のHis配列付加を行ったため、より高感度での解析が可能となる予定である。平成29年度中に、cis因子および分泌活性測定系に関する論文の取りまとめを行う。
|
| Causes of Carryover |
hexa-His付加TtsIとミヤコグサ根粒菌ゲノムDNAとの結合の特異性が低かったこと、また、西洋ミヤコグサ種子水抽出物を用いたmlr6358’-nlucの発現実験でも、非誘導時の背景活性が高かったことから、解析回数を単純に増加させる段階に至っていなかったことによる。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後の推進方策にも既述したように、２つの理由を解決すべく対策を実施しつつあるので、改善後は解析回数の増加させることが可能である。従って、消耗品等はトータルとして当初の予定通り使用する計画である。
|
