細胞間コミュニケーション可視化のための新規発光性プローブの開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07040
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 齊藤 健太 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60374659)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 細胞生物学 / 機能性バイオプローブ / バイオイメージング

Outline of Annual Research Achievements

前年度は、分子間BRET（bioluminescence resonance energy transfer）を利用した発光性のシナプス可視化指示薬の開発に取り組み、神経細胞への導入条件を検討した。本年度は指示薬の汎用性を高める観点から、発光性だけでなく蛍光性の指示薬開発に取り組んだ。シナプス前、後膜それぞれに特異的に局在するニューロリジン（NLG）、ニューレキシン（NRX）を蛍光分子と融合させた。この指示薬をそれぞれ発現した293細胞同士が密着した部分で作る擬似的なシナプスでのシグナルを確認できた。
次に、単離したマウス胎児海馬神経細胞に上記の指示薬をそれぞれ発現させ、神経細胞同士が形成するシナプスを観察できるかどうか試みた。結果的に、２種の神経細胞間がシナプスを作る領域にシグナルが観察できた。ここで、観察されたシグナルが本当にシナプスに由来するかどうかを確認する必要がある。そこで、神経シナプスマーカー（シナプス前膜：シナプトフィジン、シナプス後膜：ホーマー1）との共発現を行った。結果として、観察されているシグナルとこれらシナプスマーカーが共局在しているのが確認できた。
遺伝子導入は当初はエレクトロポレーションにて行ったが、高発現している細胞では擬似シグナルが発生しやすいことがわかった。そこで、発現量を一定にして真のシグナルだけを観察しやすくするため、アデノウィルスベクターを作成する予定でいる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

発光性だけでなく蛍光性の指示薬開発を着手したため、指示薬最適化のための時間を十分に取れなかった。しかしながら、最初の試みで神経細胞でシナプスの箇所にシグナルが順調に観られたことについては想定以上の成果であり、計画は順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

今後は、超解像顕微鏡や電子顕微鏡などを利用したシナプスの確認を予定している。また、観られたシグナルの箇所が、機能的なシナプスかどうかの確認も行う予定である。また、機能的シナプスであることを確認したのちに、シナプスの形成・消失を「可逆的に」観察可能であるかどうかを、タイムラプス観察などを通じて調査する予定である。さらに、単離した培養細胞だけでなく、海馬スライスカルチャーや動物に発現させて、より生体に近い環境での観察を行う予定でいる。

Causes of Carryover

発光性だけでなく蛍光性の指示薬の開発を開始したため、当初予定していた予算を消化することなく今年度の研究を遂行することができた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度予定に記載したとおり、１）超解像顕微鏡や電子顕微鏡などを利用したシナプスの確認、２）シグナルの箇所が機能的なシナプスかどうかの確認、３）シナプスの形成・消失を「可逆的に」観察可能であるかどうかを、タイムラプス観察などを通じて調査、４）より生体に近い環境（動物など）での観察、に使用する。