2015 Fiscal Year Research-status Report
静止中心特異的なリボソーム量制御機構の存在とその機能の解明
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15K07115
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| Research Institution | Rikkyo University |
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Principal Investigator |
堀口 吾朗 立教大学, 理学部, 准教授 (70342847)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | リボソーム / 静止中心 / 細胞周期 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではシロイヌナズナを持ちいて、根端分裂組織の静止中心におけるリボソーム量を調節する仕組みを明らかにする。リボソームタンパク質のモデルとしてRPL4に注目する。静止中心におけるRPL4の蓄積が周囲の細胞に比べ低く保たれている制御点として、RPL4AおよびRPL4D遺伝子の転写レベル、転写後レベルがありえる。これらの点を検証するため、pRPL4A::GUSおよびpRPL4D::GUSの根端分裂組織における発現パターンを解析した。その結果、静止中心でもこれらのプロモーター活性が確認できた。次にp35S::RPL4D-GFP系統を持ちいて、オートファジー阻害剤やプロテアソーム阻害剤を投与した際のGFP蛍光パターンについて解析した。これらは、観察に適した条件の検討がほぼ完了したところである。その条件を用いて、下記のpWOX5::RPL4D-GFP系統での観察を進める準備が整った。
RPL4D-GFPが静止中心で低蓄積する現象が、他のリボソームタンパク質についても当てはまるかを確認するために、他のリボソームタンパク質とGFPとの融合遺伝子を該当する突然変異株に導入し、その相補能を確認した。RPL5BおよびRPS6Aでは植物に奇形が生じ、導入した融合遺伝子が悪影響を及ぼすことがわかった。そのため、他のリボソームタンパク質を用いた解析を進めている。
RPL4D-GFPの低蓄積に関わる遺伝子を遺伝学的に探索するため、pWOX5::RPL4D-GFP系統を作出した。これは、種を増幅中であり、その種子が得られ次第変異原処理を行い、突然変異株の探索に移ることが可能となった。
静止中心の細胞分裂に影響を及ぼす既知変異株とp35S::RPL4D-GFP系統との多重系統の作成も行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究計画では、解析に用いる多くの系統の作出を初年度に行う予定であった。RPL4D以外のリボソームタンパク質について、それらとGFPとの融合遺伝子を発現させ変異株の表現型を相補する系統が得られていないことを除けば、実験系統の作出は概ね順調に推移している。この進展が遅れた点については、リボソームが多数のリボソームタンパク質の集合体であり、立体構造がその機能に非常に重要であるため、GFPの付加によってリボソームの機能が撹乱されることが原因であると考えられる。この点に対応するため、当研究室では様々なリボソームタンパク質変異株を維持している。それらの中から、解析に利用可能な系統を作出することを、丹念に進める。また、pWOX5:RPL4D::GFPは蛍光強度が観察に適している物が得られるかが不安材料であったが、観察に十分用いることができる系統が得られたので、次年度以降の研究に活用できる準備が整った。
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| Strategy for Future Research Activity |
一部進展が遅れたRPL4D以外のリボソームタンパク質とGFPとの融合遺伝子を導入する実験については、まだ試していないリボソームタンパク質について実験を進める。その際、リボソームの結晶構造を参考に、リボソームの表層に位置しているものについて、優先的に解析を進める。その他の点については、当初の研究計画通りに進める。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額は約８万円であり、実験計画の多少のズレにより27年度内に発注を行わなかった試薬類が存在したためである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度に入ってすぐに、発注が保留になっていた試薬類の購入にあてる。また、28年度は、27年度に作成した系統の薬理学的処理および生化学的解析を行う予定である。オートファジー阻害剤、各種植物ホルモン、イムノブロット用試薬、抗体等の試薬類のほか、ルーチンに必要になるプラスチック器具、植物栽培用土類等の購入にあてる。
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