2015 Fiscal Year Research-status Report
幹細胞化における細胞運命転換を制御するCDKAの標的因子の探索
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15K07119
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
石川 雅樹 基礎生物学研究所, 生物進化研究部門, 助教 (00586894)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 幹細胞化 / CDKA / ヒメツリガネゴケ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒメツリガネゴケの細胞周期制御因子CDKAによる細胞運命転換の分子機構を明らかにするため、本年度は以下の実験を行った。
1. CDKA標的因子の探索：計画では、放射性同位体元素で標識されたATPを用いた二次元電気泳動法による解析を行う予定であったが、所属機関において超高分解能フーリエ変換型質量分析装置が利用できるようになった。そこで、野生型とCDKA遺伝子欠失株（cdka変異体）からリン酸化タンパク質のみを抽出し、当該質量分析装置で解析するための条件検討を行った。
2. CDKAプロテインキナーゼ活性をモニターするバイオセンサーの開発：ホタルのルシフェラーゼをN末端側半分 (N-ルシフェラーゼ) と、C末端側半分 (C-ルシフェラーゼ) に切断し、その間にCDKA標的タンパク質の一つであるRBRタンパク質のCDKAリン酸化部位、リンカー配列、プロリン異性化酵素Pin1タンパク質内にあるWWドメインを連結したコンストラクトを作製した。このコンストラクトを野生型とcdka変異体に導入し、ルミノメーターを用いて原糸体全体での発光強度を調べたところ、cdka変異体よりも野生型で強い発光が観察された。このことから、このコンストラクトがCDKA依存的に機能していることが示唆された。しかしながら、顕微鏡システムを用いて解析では、個々の細胞からの発光が確認できなかった。理由の一つとして、ホタルルシフェラーゼの発光レベルが低いことが考えられた。そこで、ホタルルシフェラーゼよりも80から240倍の発光強度をもつウミシイタケのNanoLucを用いたコンストラクトを作製し、検証を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
微量のタンパク質を同定することが可能な質量分析装置を用いることで、リン酸化タンパク質の網羅的な解析が可能であるため、CDKA標的タンパク質の候補を同定することが可能であると考えている。また、CDKA活性をモニターするコンストラクトが、ヒメツリガネゴケで機能しうることが分かった。一方、細胞レベルでの検出には発光が弱いため、センサーを改良する必要が生じたが、より発光強度の高いNanoLucを用いることで、細胞レベルでのCDKA活性をモニターするセンサーを開発することが可能であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に引き続き、石川が研究全体を統括するとともに実験を進める。またCDKAの標的となりうるタンパク質の機能解析を補助するための技術支援員を１名雇用する。
1. CDKA標的タンパク質の同定：野生型とcdka変異体の切断葉から全リン酸化タンパク質を抽出し、質量分析装置で解析する。野生型からの抽出液のみに含まれているリン酸化タンパク質がCDKA標的タンパク質の候補となるので、in vitroキナーゼアッセイにより確認する。その後、遺伝子欠失株を作製し、幹細胞化における表現型を調べる。
2. CDKAバイオセンサーの開発：ルシフェラーゼからNanoLucに変更したコンストラクトを用いて、原糸体、および細胞レベルでの発光を調べる。また、発光強度が強くなるため、バックグラウンドも高くなる可能性が考えられる。そこで、リンカー配列の長さやアミノ酸配列の変更、ドメイン配列の順番を変えるなどの条件検討を行う。(1)で同定されることが期待されるタンパク質のCDKAリン酸化部位を含む20アミノ酸残基程度を用いたコンストラクトも作製し、評価する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額の837,466円は、CDKA標的タンパク質をコードする遺伝子の機能解析を行うため、技術支援員の雇用経費として支出する予定であった。しかしながら、CDKAの標的タンパク質を同定する実験方法を変更し、さらなる条件検討が必要になったため、当該研究費が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
CDKAの標的となりうるタンパク質の機能解析にあたって、形質転換体の作製・維持管理、および分子生物学的実験が必要なため、以下のように物品費、謝金にあてる（計837,466円）。（内訳）物品費：分子生物学実験用試薬購入費として237,466円を計上する。謝金：技術支援員1名の雇用経費として600,000円を計上する。
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