2015 Fiscal Year Research-status Report
無酸素環境で炭化水素分解を担うコア生物群の獲得と多様性解析
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15K07183
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
中村 浩平 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (40456538)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | メタン発酵 / メタ16S解析 / メタゲノム解析 / n-alkane / BTEX / MEOR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は(１)アルカン分解菌の分離と性状解析と(２)無酸素環境下における炭化水素分解菌群の多様性解析を行った。(１)において，嫌気的アルカン分解に関与すると示唆されているPeptococcaceae科とSmithella属の未培養細菌が集積されているアルカン分解メタン発酵培養系を植菌源に用いPeptococcaceae科未培養細菌の集積培養を試みた。メタゲノム解析の結果，未培養Peptococcaceae科細菌には嫌気的アルカン分解に関わる遺伝子に加え，酪酸やプロピオン酸の酸化能，および異化的フマル酸塩還元能を有する可能性が示唆されたため，アルカンに加え，酪酸とプロピオン酸，更にフマル酸塩を添加した。その結果，フマル酸塩のコハク酸塩への還元と，アルカン(n-オクタン)の分解がGC-MS解析によって確認された。集積培養菌体のメタ16S解析を行った結果，未培養Peptococcaceae科細菌は殆ど存在せず，好気性のAcinetobacter属細菌が存在した。Acinetobacter属細菌は好気的アルカン分解菌であり，培養系内に酸素の混入ないし，Acinetobacter属細菌による未知の嫌気的アルカン分解の可能性も示唆された。(２)において， Fe(III)，硫酸塩をそれぞれ添加した芳香族炭化水素(トルエン)分解培養系の構築を行い，集積系細菌群集のメタ16S解析を行った。Fe(III)，硫酸塩添加両系において，既知のトルエン分解Fe(III)還元細菌やトルエン分解硫酸塩還元細菌が検出された。また，両系において最優占種でないものの，数%以上の割合で未培養Betaproteobacteria綱細菌が存在し，これに近縁の配列がタールオイル汚染サイトでも検出されていた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初予定していた安定同位体を用いた(中間)代謝物の解析は，本実験に用いるための集積培養系の生育が遅く，十分な菌体量が得られなかったため実験開始に至らなかった。現時点で新たな集積培養系を起ち上げている段階であり，安定同位体を用いた代謝物解析実験は今後の培養状況によって実施する。また，アルカン分解メタン発酵培養系が，酢酸生成を主体とするメタン発酵系であることが考えられたため，酢酸資化性の硫酸塩還元菌や鉄還元菌を培養系に添加する実験系についても，上記と同様に培養実験に用いる集積培養系の生育を待つ段階であり，培養状況によって今後実施する。未培養Peptococcaceae科細菌の取得を目的とした，アルカン-低級脂肪酸-フマル酸塩培養系において，目的としないAcinetobacter属細菌が集積されたが，これまでに油田環境から嫌気的原油分解微生物群集から同じく好気性のMarinobacter属細菌が検出されていることもあり（Gray et al., Environ. Microbiol., 2011），Acinetobacter属が嫌気的にアルカン分解に関与する可能性も考えられる。今後はAcinetobacter属細菌の関与について検討する。Fe(III)や硫酸塩を還元するトルエン分解系については，培養系の構築に成功したので今後更に集積を進め，嫌気的トルエン分解のコア生物の特定を試みる。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) アルカン分解菌の分離と性状解析 [メタゲノム解析] 平成27年度と同様に解析を継続する。[安定同位体基質代謝解析と中間代謝物解析] 13C-アルカンを用い，十分な生育がある集積培養系から，継代培養を行う。代謝物である安定同位体代謝産物の解析（GC-MS）を行い，アルカン代謝経路の確認を行う。[培養]メタゲノム解析で得られた情報を基に各種培養条件を試み，Peptococcaceae細菌の分離培養を行う。酢酸資化性の各種嫌気性菌(Geobacter属やDesulfonema属)とその電子受容体(Fe(Ⅲ)や硫酸塩)を含む培地に，十分な生育がある集積培養を植菌し，共培養系中のアルカン分解や電子受容体濃度の減少をGC-MS,IC等で確認する。更にPeptococcaceae科細菌の定量をFISHやQPCRで行い，共培養によるPeptococcaceae科細菌の高速培養を評価する。
(2) 無酸素環境下における炭化水素分解菌群の多様性解析 平成27年度に準備した嫌気分解系のメタ16S解析と嫌気的炭化水素分解機能遺伝子解析(bssAやassA等)を行う。 各試料から構築した分解菌群の中から，基質(炭化水素種や電子受容体種)に依存するコア生物を特定する。 また，培養系内に存在する炭化水素の中間代謝産物を分析し代謝経路の推定を行う。
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| Causes of Carryover |
備品として購入予定であった「メタゲノム，メタ16S解析用サーバー一式」の仕様を予算申請当初の予定より改善するために，他予算との合算で仕様を変更した。他予算の取得と詳細な仕様の選定の遅れによって年度内に購入できなかったが，平成28年度内に使用予定である。尚，メタゲノム解析やメタ16S解析には学内の共通サーバーを借用して行ったため，平成27年度内の研究には大きな支障はなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
備品「メタゲノム，メタ16S解析用サーバー一式」として使用する予定である。
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