2015 Fiscal Year Research-status Report
原核生物Hsp90（HtpG）と新規ClpBのシャペロン作用機構の解析
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15K07349
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
仲本 準 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (30192678)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 分子シャペロン / Ｈｓｐ９０ / ＨｔｐＧ / ＣｌｐＢ / シアノバクテリア / タンパク質の凝集 / シャペロンネットワーク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的の一つは、我々が明らかにした新規シャペロン系HtpG-DnaK2/DnaJ2/GrpEの調節機構を解明することである。DnaJ2がDnaK2のみならず、（コシャペロンとして）HtpGの機能をも調節するのではないかと仮定して研究を進めてきた。DnaJ2のJドメイン（JD）と、JDを含まないC末側領域（ΔJD）を調製した。ΔJDのみが HtpGと相互作用し、そのシャペロン（凝集阻止）活性を低下させた。一方、ΔJDはDnaK2の凝集阻止活性に影響を与えなかった。これは、DnaJ2がHtpG-基質複合体の安定性を調節して、基質の（HtpGからの）解離あるいはDnaK2への移動を容易にすることを示唆するものである。
本研究で用いるS. elongatusを含む多くのシアノバクテリア（ゲノム）には、大腸菌等の従属栄養細菌とは異なりClpBをコードする2種類の遺伝子（clpB1とclpB2）が存在する。本研究のもう一つの目的は、これらのClpBの生化学的特徴を明らかにすることである。以下の１～３に示す結果から、ClpB2は、ClpB1やこれまでに研究されてきた大腸菌ClpBや酵母Hsp104（ClpBホモログ）とは生化学的に顕著に異なる、新規なClpBであることが強く示唆された。
１．ClpB1に比べるとClpB2のATPase活性は著しく低かった。ClpB1は、DnaK2/DnaJ2/GrpEシャペロン系と協調的に、変性タンパク質の凝集塊を可溶化し、そのrefoldingを助けるのに対して、ClpB2は可溶化/refoldingを「阻害」した。
２．大腸菌ClpBや酵母Hsp104とは異なり、シアノバクテリアClpB1とClpB2の両方には変性タンパク質の凝集形成を阻止する活性が検出された。
３． ClpB1は6量体を形成するのに対して、6量体ClpB2の検出は不可能であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々は、DnaJ2のJドメイン（JD）がDnaK2と、DnaJ2の（JDを含まない）C末側領域がHtpGと相互作用することを明らかにし、さらにHtpG-DnaJ2-DnaK2の3者複合体（foldosome）形成を示唆する結果を既に得ている。平成27年度の成果の一つは、DnaJ2が、DnaK2の凝集阻止活性には影響せずに、HtpGのそれを特異的に調節することを見出したことであり、これは上記の新規foldosomeの機能調節機構を明らかにする上で重要な知見である。
また我々は、ClpB1およびClpB2が変性タンパク質の凝集阻止活性を示すというシアノバクテリア特有の性質をもつことを明らかにし、さらにClpB2がClpB1や従来研究されてきた大腸菌ClpB/酵母Hsp104とは異なる構造や機能をもつ新規なClpBであることを明確に示すことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
DnaJ2がHtpGのシャペロン（凝集阻止）活性を阻害することが明らかになったが、反応条件を変えて、この結果を確認する必要がある。例えば、ATPやADP等のヌクレオチド存在下で実験を行う。HtpG/Hsp90は、アポ型、ATP結合型あるいはADP結合型などの異なるコンフォメーションをとることが明らかにされているが、異なるコンフォメーションのHtpGに対するDnaJ2の調節様式を解明する必要がある。DnaJ2のJドメイン（JD）を含まないC末側領域（ΔJD）が HtpGと相互作用することを明らかにしたが、今後、ΔJDの相互作用部位（アミノ酸残基等）を特定する必要がある。
HtpG-DnaK2/DnaJ2/GrpEシャペロン系の機能調節を解明するためのツールとして、HtpGの活性を調節する小分子化合物は有用である。我々は新規な活性化剤を最近発見したが、今後、HtpGのATPase活性を増加あるいは減少させる小分子化合物の探索をさらに進めていく予定である。
ClpB1とClpB2には（従来研究されてきた大腸菌ClpBや酵母Hsp104とは異なり）凝集阻止活性が検出された。この凝集を免れた変性タンパク質が元の機能的構造に折り畳むかどうかをDnaK2/DnaJ2/GrpE/ATPを加えて解析する。この実験は、シアノバクテリアClpBがタンパク質の品質管理上重要な新規機能をもつことを確認する上で重要である。
研究計画に記したように、ClpB2のMドメインに注目して、これをClpB1のMドメインと交換したものや、Mドメインに部位特異的なアミノ酸変異を導入した変異体を構築する。これらのClpB2変異体がClpB1の性質を示さない場合には、他のドメインのスワッピングも行い、どのようにしてClpB1とClpB2の構造・機能分化が生じたのか、その進化の過程を考察する。
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| Causes of Carryover |
二国間交流事業共同研究（平成26/27年度・日本学術振興会）における海外共同研究者の国内滞在日数が（共同研究者の都合により）実施計画で予定されていたよりも大幅に少なくなった。このために、この共同研究費における消耗品や謝金等の（使用可能）額が増え、当該助成金からの支出を抑えることができたので、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
経年劣化している機器（クリーンベンチなど）の修理や、国際会議出席・成果発表のために用いる予定である。
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