2015 Fiscal Year Research-status Report
細菌キチナーゼによるプロセッシブな結晶性キチン分解機構解明の新展開
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15K07355
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
渡邉 剛志 新潟大学, 自然科学系, 教授 (10201203)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | キチナーゼ / CBP21 / 結晶性キチン / 高速原子間力顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、「自然界に圧倒的に多く存在するα-キチンの分解機構の解明」、「細菌のキチン分解酵素系の主要メンバーとして認知されつつあるキチン分解促進蛋白質（AA10蛋白質・CBP21）の結晶性キチン分解利用における役割の検証」、「キチン分解細菌の生物機能におけるAA10蛋白質の重要性の解明と補助因子の探索」、などの研究によって、“より普遍的で進化した結晶性キチン分解機構モデルの提案”を目指している。
平成27年度は、Serratia marcescensのキチナーゼであるSmChiA, SmChiBとPhaeocystis 由来高結晶性α-キチン微小繊維を用いてα-キチン分解機構を解明するため、SmChiA によるα-キチン分解の高速原子間力顕微鏡によるリアルタイム観察の条件の検討をまずおこなった。その結果、β-キチン微小繊維を用いた場合と類似の条件での観察が可能であることがわかり、予備的な観察に成功した。また、細菌によるキチン分解利用におけるCBP21の役割の検証のために、CBP21をコードする遺伝子の欠損変異株の構築を試み、その取得に成功した。その変異株を用いて、CBP21が細菌のキチン分解利用に非常に重要であることを明らかにすることに成功するとともに、S. marcescensの培養上清中にCBP21の補助因子が存在する可能性を強く示唆する結果が得られた。さらに、これまで結晶性キチン分解への重要性がわかっているSmChiB分子表面に存在する４つの芳香族アミノ酸残基のうち、特に触媒クレフト入り口に存在するTyrに着目し、各種のアミノ酸残基への置換を行った。その結果、結晶化度の高い基質分解には、触媒クレフト入り口に大きな共鳴構造の芳香環が重要であり、水溶性高分子基質の分解には逆に芳香環がない方が有利であることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Phaeocystis 由来の高結晶性α-キチン微小繊維を用いたS. marcescensのキチナーゼによるα-キチン分解機構の解明の実験に関しては、当初は生化学的分析から取り掛かる予定であった。しかし、試料であるα-キチン微小繊維の量が微量であることから、まず高速原子間力顕微鏡観察を優先することとし、そのために最も重要な高結晶性α-キチン微小繊維の観察条件の検討を試み、その確立に成功した。そして、予備的な観察によって、高結晶性α-キチン微小繊維上のSmChiA 分子の観察が可能であることを示す結果がすでに得られている。
キチン分解促進蛋白質CBP21の結晶性キチン分解利用における役割の検証に関しては、すでにCBP21の遺伝子欠損変異株の取得に成功し、細菌自身にとってのCBP21の重要性を初めて明らかにできた。また、本研究を構成する幾つかの研究項目の中でCBP21を中心とした研究項目の重要な目的の一つである補助因子の探索の前提となる、培養上清画分のキチン分解促進効果を示す実験データを得ることに成功した。さらに、α-キチン分解機構解明や、キチナーゼによるキチン分解に対するCBP21の促進機構解明の前提となる、SmChiBの分子表面の芳香族アミノ酸残基に関しても、結晶性キチン分解に最も重要な残基と考えているTyr-240の機能に関する詳細な知見を得ることに成功した。
以上のように、当初の実験計画の軌道修正や、実験の順番を変更した点はいくつかあるが、変更後の実験全てにおいて重要な知見が得られており、順調に進行しているということができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
「Phaeocystis 由来の高結晶性α-キチン微小繊維を用いた、SmChiA、SmChiBによるα-キチン分解機構の解明」に関しては、高速原子間力顕微鏡による観察条件の設定に成功したので、SmChiAおよびSmChiBによる高結晶性α-キチン微小繊維分解のリアルタイム観察を２８年度も継続して試みる。当面高速原子間力顕微鏡観察を優先するが、高結晶性α-キチン分解の生化学的な解析については、Phaeocystis 由来の高結晶性α-キチン微小繊維が非常に貴重な試料であるため、微量の試料で解析可能な手法を検討しつつ、２８年度後半から進めていく予定である。
「キチン分解促進蛋白質（AA10蛋白質・CBP21）の結晶性キチン分解利用における役割の検証」に関しては、CBP21遺伝子欠損株の取得に成功し、細菌自身にとってのCBP21の重要性を初めて明らかできたが、この変異株を用いてさらに多くの情報が得られると考えられるため、その解析を継続する。それによって、S. marcescensのキチン分解利用におけるCBP21の重要性をさらに確実なものにすると共に、昆虫病原性やその他の生理機能におけるCBP21の重要性を明らかにしていく。
また、CBP21の補助因子の探索の前提となる培養上清のキチン分解促進効果を示す結果が得られたため、その補助因子を同定するための培養上清成分の分画法の検討、最も効率的な分解促進効果の検出法の検討をすすめ、研究期間内における補助因子の同定と構造解明を目指して実験を進める予定である。
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