2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K07371
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| Research Institution | Hosei University |
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Principal Investigator |
佐藤 勉 法政大学, 生命科学部, 教授 (70215812)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 枯草菌 / 溶原性ファージ / DNA組換え / 遺伝子再構築 / DNA組換え酵素 / 胞子形成 / ウイルス / 脱分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、枯草菌の胞子形成期母細胞において、ファージDNA により分断された遺伝子が再構築する機構の解明とその応用研究を行っている。本課題では、研究対象である１．SPβファージによる枯草菌胞子形成期の遺伝子再構築機構を、部位特異的組換え酵素とRDFを用いてin vitroレベルで詳細に解明する。また、２．これまでに得られたSPβの組換え機能の知見を基に、枯草菌の脱分化細胞の判別法の開発、および３．新たなゲノム改変ツールの開発を行い応用研究へ発展させることを目的とした。本年度は、
１．精製したセリンタイプの部位特異的組換え酵素SprA およびRDFであるSprBを用いて、最小attP, B, L, R部位の決定を行なった。また、attPの切断・再結合部位を変異導入法で決定し、逆向き反復配列の中心に位置するAAが突出する形で起こることが確認された。
２．前年度、枯草菌最終分化細胞の脱分化誘導系を構築したが、この脱分化を検出できる実験系Pxyl-attB-gfpを開発した。attBにSPβファージを溶原化させると、GFP蛍光が消失する。SPβは母細胞で切り出されるため、母細胞から脱分化した細胞はGFP蛍光を発するため栄養細胞との識別が可能である。
３．枯草菌のspo0A遺伝子の近傍にkan-sprA-attRを、そのspo0A側25 kb上流にerm-sprB-attLを配置した。sprBはIPIGで誘導可能なプロモーターの制御下に置き、IPTGにより25 kbの欠失が誘導できる株を構築した。IPTGによる欠失は耐性マーカーermとkanの脱落、即ちエリスロマイシン耐性とカナマイシン耐性が消失していることにより確認できる。耐性マーカーが脱落している株を調べたところ25 kbの欠失が確認でき、この株はspo0Aが失われたことにより胞子形成能が欠損した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．SPβファージの部位特異的組換え酵素とRDFを用いたin vitroレベルでの解明ついては、精製した酵素を用いて、最小att siteの決定や、切断・結合部位の決定など、ほぼ解析が終了し、論文投稿を行い現在Revise中である。
２．一方、枯草菌の脱分化細胞の判別に用いる研究については、昨年度作製した脱分化誘導系に、SPβファージを用いた脱分化検出系を加え、栄養細胞と母細胞からの脱分化細胞とを識別する系が構築できた。
３．また、新たなゲノム改変ツールの開発については、SPβファージの組換えユニットを用いる系で、IPTG誘導により誘導可能であることが確認された。skin elementの組換えユニットを用いる系は、切り出しに必要な因子の発現調節機構が翻訳レベルでも行われている可能性が考えられ、この解析に時間を要している。
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| Strategy for Future Research Activity |
SPβのDNA組換えのin vitroでの実験系については、予定よりも早く進行し論文Reviseの段階に入っている。今後は、部位特異的組換え酵素SprAのドメイン解析を進めて行きたい。脱分化誘導系については、脱分化の検出系が構築できた。今後は脱分化の効率を調べる予定である。再編成システムを使ったゲノム改変ツールの開発については、SPβファージの組換えユニットを用いる系が確立した。今後は欠失サイズを拡大し、実用性を検討したい。また、skin elementの組換えユニットもゲノム改変ツールとして利用できるように実験系の確立を推進させたい。
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| Causes of Carryover |
本研究は、（１）SPβファージの部位特異的組換え酵素とRDFを用いたin vitroレベルでの解明、（２）この組み換えシステムを枯草菌の脱分化細胞の判別に用いる研究、（３）新たなゲノム改変ツールの開発で構成されているが、研究（１）の進行が予定よりも早く、論文作成の段階に達した。従って、消耗品などの物品費が予定額よりも少額となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度は、主に（２）この組み換えシステムを枯草菌の脱分化細胞の判別に用いる研究、（３）新たなゲノム改変ツールの開発の研究に注力するための物品費、これらの研究を遂行するため人件費、また、研究成果を国際学会（ドイツ）の場で発表するための旅費に充当する。
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Research Products
(21 results)
