2017 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis and application of prophage-mediated gene reconstitution
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15K07371
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| Research Institution | Hosei University |
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Principal Investigator |
佐藤 勉 法政大学, 生命科学部, 教授 (70215812)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 部位特異的組換え / 枯草菌 / 胞子形成 / 細胞分化 / 遺伝子再構成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、枯草菌のSPβファージDNA により分断された遺伝子spsMが胞子形成期母細胞において、再構築する機構の解明とその応用研究を目的としている。本年度の実績を以下に記す。
１．SPβプロファージの部位特異的組換え酵素(Int)をコードするsprA およびRDFをコードするsprBの胞子形成期母細胞での発現に着目した。sprAは構成的に発現し、sprBは母細胞特異的σ因子σE/Kおよび転写因子GerEにより転写され、その発現は胞子形成の最終段階まで継続する。このsprBのプロモーターをσEのみで認識されるプロモーターに置き換えたところ、SPβのspsMへの再挿入が検出された。また、再挿入により、spsMが再び分断され、胞子ポリサッカライドの消失が見られた。従って、sprBの継続した発現が、組換えの方向を挿入から欠失に切り替えた状態を維持するために重要であることが示された。一方、この組換えの方向性を変換するSprBが、SprAにアクセスするために必要なSprAの構造上の領域を調べた。欠失解析により、SprAのC末端側に位置するアミノ酸配列が方向性を換えるために重要であることが明らかとなった。
２．枯草菌最終分化細胞の脱分化誘導系を構築し、この脱分化を検出できる実験系Pxyl-attB-gfpを開発した。しかし、母細胞を脱分化させるとsprBの発現が消失し、SPβが再挿入されるため、最終的に母細胞由来の脱分化細胞を確定できないことが新たに示された。従って、SprAの組換えをSprBを要求せず、欠失方向のみに向かう変異SprAの作製が必要であることが認識された。
３．組換えユニットattL-rdf-int-attRを利用した長距離DNA欠失系を、SPβおよびskin elementの組換えユニットを用いて作製した。いずれも25kbまでの欠失が可能であることが示された。
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