2016 Fiscal Year Research-status Report
Project/Area Number |
15K07511
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Research Institution | Kyoto University |
Principal Investigator |
粟野 達也 京都大学, 農学研究科, 助教 (40324660)
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Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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Keywords | G層 / 引張あて材 / 高圧凍結法 / 凍結割断法 / FESEM / マクロフィブリル / ガラクタン |
Outline of Annual Research Achievements |
2016年4月7日に交雑ポプラ(Populus carolinensis x P. nigra I-214)1個体を約30~45度傾斜し、ロープで固定した。6月23日に傾斜上側の分化中木部を露出し、ひずみゲージ法により表面成長応力解放ひずみを測定した。傾斜下側に比べて大きな縮みの解放ひずみが測定された。測定部位付近より分化中木部を含む小ブロックを数個切り出し、グルタルアルデヒドで固定した。一部のブロックは脱水後、樹脂包埋した。残りのブロックからスライディングミクロトームを用いて連続板目面切片を作製した。樹脂包埋ブロックより薄切片を作製し、光学顕微鏡で観察によりG層を有するゼラチン繊維の形成が確認した。薄切片を抗ガラクタン抗体(LM5)で標識したところ、G層形成初期のゼラチン繊維ではG層全体に標識がみられたが、形成後期ではS2層とG層の境界付近およびG層の内表面に標識が見られた。 連続板目面切片を高圧凍結装置(HPM100、Leica Microsystems)を用いて高圧凍結した。凍結した切片を凍結割断試料作製装置(JFD-9010、日本電子)に入れ、高真空下、温度-123K以下で割断した。割断した試料は液体窒素で冷却した真鍮製容器に入れ、真空蒸着装置(JEE-4B、日本電子)内で真空乾燥した。乾燥した割断切片を走査電子顕微鏡試料台に載せ、イオンスパッタで白金コーティングし、フィールドエミッション走査電子顕微鏡(S-4800、日立)で観察した。G層形成中木部繊維の細胞壁割断面はS2層であることが多く、G層の外表面がまれに露出した。G層外表面のマクロフィブリル径を測定したところ、G層形成初期よりも形成後期で径が大きくなっていた。この部分はガラクタン標識に変化は見られないことから、形成に伴うマクロフィブリル径の変化はガラクタン以外のマトリックス成分の堆積によるものと考えられる。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
引張あて材の誘導、表面成長応力解放ひずみの測定、試料の採取、固定、樹脂包埋、ガラクタンの免疫標識、連続板目切片の作製、高圧凍結、凍結割断、凍結乾燥、フィールドエミッション走査型電子顕微鏡による観察、以上の一連のワークフローを確立することができた。 凍結割断ディープエッチング法による細胞壁微細構造の観察では、当初金属圧着法による急速凍結を予定していたが、従来の急速凍結法よりも広範囲に無氷晶の凍結領域を得ることができるとされる高圧凍結装置(HPM100、Leica)が所属研究室に導入されることになった。そこで、凍結割断ディープエッチング法および透過電子顕微鏡による観察を一旦中断し、高圧凍結装置HPM100から凍結割断試料作製装置日本電子JFD-9010へのワークフローの構築を検討した。具体的には、両装置で相互運用可能な試料キャリア形状の選定およびそれらをJFD-9010で利用するためのホルダの設計をした。 凍結割断後に凍結乾燥した試料をフィールドエミッション走査型電子顕微鏡(FESEM)で観察したが、FESEMが十分な分解能を持ち、しかも広い視野で観察できるという利便性を改めて実感した。一方で、高圧凍結時の高圧によるものとも思われる試料の圧縮変形が生じることと凍結割断箇所がS2層にほぼ限られるという解決が必要な問題が新たに生じた。
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Strategy for Future Research Activity |
当初計画では、あて材形成過程における細胞壁微細構造の変化を凍結割断ディープエッチング法(FFDE)でレプリカ膜を作製して透過電子顕微鏡観察するとともに、次世代シーケンスにより形成過程での遺伝子発現変動を調べる予定であった。 FFDEでは観察試料を氷晶のない状態で凍結することが必須であるが、従来の急速凍結法では試料表面のごく限られた深さしか凍結できず、観察の効率が悪いとともに、アーティファクトが生じる可能性が高い。この問題は高圧凍結(HPF)を用いることで解決できると考えられる。 木材組織からレプリカ膜を作製する場合、試料の洗浄過程でレプリカ膜が断片化するため、組織レベルの広視野で観察することは難しい。しかし、FFDE後にレプリカ膜を作製せず、凍結乾燥し、フィールドエミッション走査電子顕微鏡(Cryo-FESEM)で観察することができれば、広視野かつ高分解能で細胞壁微細構造を観察することができる。これまでのところ、HPF、FFDEからFESEMのワークフローで分化中木部細胞の細胞壁微細構造の観察を行った例はほとんどない。この手法を確立することは本研究課題のあて材形成過程の観察のみならず、正常材の細胞壁形成の研究にも重要である。今年度一連のワークフローを確立できたが、高圧凍結時の試料の圧縮変形と任意の割断面が得られないという問題が生じた。 そこで、試料圧縮が生じないような試料キャリア設計を行う。また、割断温度と割断方向の検討により、任意の割断面を得る方法を確立する。 上記と並行し、次世代シーケンスによる形成過程での遺伝子発現変動を実施する。
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