2015 Fiscal Year Research-status Report
高選択性阻害剤の創出を促進するＭＡＰ２Ｋの自己阻害機構の解明
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15K07897
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
木下 誉富 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (90405340)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | キナーゼ / Ｘ線結晶構造解析 / 自己阻害構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
MAP2K7の不活性体について高純度精製法を確立し、ATP類縁体存在下で結晶化に成功した。放射光施設においてＸ線回折データを取得して構造解析を行ったところ、不活性体MAP2K7はATP非結合型の自己阻害構造をとることが示唆された。Cys218とGly147の間に形成されたn-σ*相互作用がこの構造を安定化している。その結果としてATP結合部位が閉じた状態で極端にせまくなり、ATPの結合を阻害していると考えられる。そこで、MAP2K7特有のアミノ酸であるCys218（他のMAP2KではSer)をSerに変異したC218S変異体を調製し、Ｘ線結晶構造解析を行った。C218SではATP結合部位が開いた状態であることがわかった。したがって、今回得られたMAP2K7の構造は、ATP非結合型の自己阻害構造であると結論された。
一方、本研究の後に行う創薬研究の展開のために、共有結合性阻害剤5Z-7-oxo-zeaenolとの複合体のＸ線結晶構造解析を行った。奇しくもMAP2K7特有のCys218と共有結合していることがわかり、高選択性阻害剤創出に向けた重要なデータとなった。
MAP2K3及びMAP2K5についてキナーゼドメインの大腸菌発現系の構築を行い、低純度ではあるがそれぞれ不活性体蛋白質を取得した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
野生型及び変異体のＸ線結晶構造解析を行い、計画通りにMAP2K7の自己阻害構造を明らかにした。これに加えて、本研究後の創薬研究につなげる阻害剤-MAP2K7複合体の結晶構造解析に成功している。
さらに計画を前倒しし、MAP2K3及びMAP2K5についてキナーゼドメインの大腸菌発現系の構築に成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
・MAP2K7の自己阻害構造について論文化を進める。
・MAP2K7と同様の方法で、MAP2K3及びMAP2K5の自己阻害構造を明らかにする。発現量が少ない、精製純度が上がらないなどの問題が生じた場合には、発現コンストラクトの変更あるいは無細胞系による発現方法を検討する。
・野生型MAP2K7は非常に不安定であり、生物物理化学実験を行うために非常に不利である。将来を見据えて、安定変異体の取得実験を行う。
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