2015 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
15K08002
|
|---|
| Research Institution | Showa University |
|---|
Principal Investigator |
高松 智 昭和大学, 薬学部, 准教授 (30236351)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福村 基徳 昭和大学, 薬学部, 助教 (00407529)
小池 佑果 昭和大学, 薬学部, 助教 (10644479)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 老化 / 生薬 / 抗酸化 / SIRT1 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
酸化ストレスと老化や寿命は密接に関わっており、赤ワインに含有されるポリフェノールの一種であるレスベラトロールのように、抗酸化作用を有し、かつ長寿遺伝子産物SIRT1の活性化作用を有する天然由来の化合物の探索を開始した。一次スクリーニングでは蛍光色素（DCFH-DA）を用いた単球性白血病細胞内の酸化状態を測定する系や非細胞系の化学反応ベースのDPPHラジカル測定法などの簡便な評価系を組み合わせて実施した。
市場で入手した96種の生薬を70%メタノールで抽出し、乾固した後、(Dimethyl sulfoxide、略称DMSO)で調製し、スクリーニングに供した。
スクリーニングの開始当初は、生薬の入手数が少なかったため、上記二種の抗酸化試験に加え、NAD(+)依存性脱アセチル化酵素SIRT1の活性化試験や細胞毒性についても併行して評価した。各試験では陽性対象として、レスベラトロール、ピセアタンノール、アスコルビン酸、α-トコフェロール誘導体のtroloxを用いた。
これまでに97種の生薬の70%メタノール抽出エキスをスクリーニングした結果、キョウカツ、トウキ、トウドクカツ、トウヒ、ロートコンの各エキスが酸化ストレスを軽減し、SIRT1を活性化する成分含有候補としてピックアップされた。その中で、比較的SIRT1の活性の高かった生薬トウドクカツ（セリ科シシウドAngalica pubescens Maxim.の根）に含有される活性成分の探索を開始し、これまでにxanthotoxinやostholなど7種のクマリン誘導体を分離した。今後、得られた化合物の抗酸化活性やSIRT1活性の評価を行う予定である。また、スクリーニング対象の生薬や薬用植物素材をさらに入手し、スクリーニングを継続する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
一次スクリーニングとして、peroxide感受性の蛍光色素とヒト骨髄性白血病細胞HL-60細胞を用いたDCFHDA法とDPPH法を併用し、96種の生薬エキスについて抗酸化活性を測定したところ、両測定法でいずれも70%以上の抗酸化活性を示すものは現時点では見出されていない。また、当初予定していた二次スクリーニングの線虫による延命効果の評価は、線虫の保管・飼育不備の理由から実施を一時的に中断し、直接寿命遺伝子産物のSIRT1の活性測定を一次スクリーニングと併行して実施した。その結果、キョウカツ、トウキ、トウドクカツ、トウヒ、ロートコンの各エキスが、SIRT1を活性化（コントロールに対し2倍以上の活性化が見られたもの）することが観測された。特にトウドクカツとロートコンエキスは0.5 mg/mLで5.96、5.50倍（陽性対象：レスベラトロールは22.7μg/mLで1.8倍）のSIRT1の活性化をそれぞれ示した。まず、トウドクカツ（100 g）の70%メタノールエキスを調製した後、極性の異なるヘキサン、クロロホルム、n-ブタノールで順次分配し、活性が比較的強かった、クロロホルム画分について、活性成分の分離を進めた。これまでに7種の化合物を単離し、構造決定を行ったところ、xanthotoxinやostholをはじめとする7種のクマリン誘導体を同定した。今後は、各化合物の抗酸化活性やSIRT1活性を測定する。またクロロホルム画分の他の化合物の単離を継続する。
また、新たな生薬の収集、サンプルエキスの調製とスクリーニングを継続する。
|
| Strategy for Future Research Activity |
一次スクリーニングでは化学反応ベースのラジカル消去能を測定するDPPH法と細胞内過酸化物を検出するDCFHDA法を併用して実施したが、期待できるほどの活性を示したエキスは見出されなかった。二次評価で線虫を用いることを考慮して、細胞を用いるDCFHDA法に重点を置き、細胞毒性の見られない生薬エキスの選択に移行する予定である。
また、スクリーニングライブラリーの拡充のため、より多くの生薬サンプルの入手に加え、他に植物の種子、球根などできる限りの天然素材の入手を試みる。特に、植物の発芽時には、外敵に対する防衛の点から特殊でユニークな化合物を蓄積することも期待できることから、発芽体のエキスを可能な限り調製し、供給したいと考えている。
平成28年度も引き続き、SIRT1の活性化の評価は、抗酸化物質のスクリーニングと併行して実施する。
線虫の凍結保存機器の故障のため、現時点では生薬エキスや単離化合物の線虫に対する寿命延長効果の測定を中断している。今後は線虫を新たに入手する予定であるが、現時点では培養細胞系を用いた毒性試験とSIRT1の活性試験と組み合わせて、線虫に代わる評価系として実施している。
|
| Causes of Carryover |
平成27年度と同様にスクリーニング評価の継続のために、生薬や植物の入手に関わる費用、培養細胞の維持のための培地、血清、培養器具一式、評価対象の成分分析や分離・精製に要する有機溶媒や各種試薬、機器測定の費用、そして成果発表のための学会や関連シンポジウムの参加費用として、平成27年度とほぼ同額の予算を計上している。
また、平成28年度の申請額は、作用機序の解明や動物評価系の実施に関わる準備費用が新たに生じ、それに伴う実験手技の取得やそれらに関連する講習会に参加するための講習費用や交通費の支出、スクリーニングの天然素材の拡充のために、平成27年度の未使用額と合わせて使用する。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度の申請額は消耗品費として、評価試験に関わる器具や試薬に60万円、化合物の分離・構造決定に9万円、天然素材の入手に15万円、学会参加費用に44万円、専門知識、技術の取得、講習会の参加に9万円、論文の投稿に関わる費用として、8万円の計145万円の使用を見込んでいる。また、平成27年度の未使用額は、活性化合物の分離・精製の作業の増加に伴って発生する試薬や天然素材の入手の拡充と抗酸化化合物の作用機序解明の準備に新たに発生する費用に充てる予定である。
|
