2015 Fiscal Year Research-status Report
抗原・アジュバント複合化ナノ粒子を用いた経皮ワクチンシステムの開発
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15K08108
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
藤井 まき子 日本大学, 薬学部, 教授 (50199296)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡辺 善照 昭和薬科大学, 薬学部, 教授 (70175131) [Withdrawn]
小泉 直也 昭和薬科大学, 薬学部, 講師 (80433845)
田口 博之 日本大学, 薬学部, 准教授 (60236403)
橋崎 要 日本大学, 薬学部, 准教授 (60318459)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ナノ粒子 / 皮膚 / ワクチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
感染の予防にはワクチン投与が重要であるが，原則として注射投与である。近年，経皮ワクチンが注目されているが，抗原は皮膚透過しにくいため，マイクロニードルによる強制的な皮膚内投与が中心で，これは本質的には注射と変わらない。これまでに，脱毛により局所のランゲルハンス細胞が数日間活性化すること，ナノ粒子を経皮適用すると脱毛直後に適用した場合，毛包に蓄積しやすいことを見出している。このような現象を利用し，アジュバント効果を含めた最適なナノ粒子を設計し，毛包をターゲットとしたワクチン製剤の開発を試みる。
卵白アルブミン（OVA）をモデル抗原，アジュバンドとして酸化チタンナノ粒子を用いた製剤をヘアレスマウスに投与した。皮下注射ではOVA単独に比べ酸化チタンが共存することにより有意に抗体価の上昇が見られ，酸化チタンの共存によるタンパク抗原性に変化がないこと，感作を高めるうえで有用であることを明らかにした。しかし，皮膚適用では，リポサッカライドを腹腔内投与して免疫を亢進した状態で投与しても抗体価に変化がなかった。
これまで基剤として水系基剤を用いていたが，皮膚に浸透しやすいといわれている油性基剤の皮膚塗布時の状態を，共焦点レーザー顕微鏡を用いてリアルタイムで観察する方法を開発した。油により毛包への侵入が異なることを明らかにした。
また，抗原タンパクは親水性で油に配合することは難しいが，OVAを配合できるW/Oエマルションを開発した。モデルとしてFITC標識デキストラン（分子量4000，FD4）を配合し，Yucatan micropig皮膚に適用したところ，皮膚中にFD4の蛍光が確認され，皮膚移行の可能性が示された。
本年度は基剤の選択に関する検討は予定通りの成果を上げることができたが，やや進行が遅れたため，感作性評価に至らなかった。今後，ヘアレスマウスに適用し，感作性の評価を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
水系基剤を用い，酸化チタンをナノ分散させる方法を開発した。濃度約0.3％，平均粒子径70nmの分散液が得られたので，これに卵白アルブミン（OVA）をモデル抗原として加えた製剤をヘアレスマウスに投与した。皮下注射ではOVA単独に比べ酸化チタンが共存することにより有意に抗体価の上昇が見られ，酸化チタンの共存によるタンパク抗原性に変化がないこと，また，感作を高めるうえで有用であることを明らかにした。しかし，皮膚適用では，リポサッカライドを腹腔内投与して免疫を亢進した状態で投与しても抗体価に変化がなかった。
そこで，基剤の皮膚との親和性を考慮し，適切な油性基剤を選択するために皮膚塗布時の基剤の状態を共焦点レーザー顕微鏡を用いてリアルタイムで観察する方法を開発した。種々の油の適用直後の皮膚表面，表皮での移動状況を蛍光物質ナイルレッドを用いて観察したところ，油の粘性，表面張力により毛包への侵入が異なることが明らかとなった。外用剤として使用前例があるものとしては，軽質流動パラフィン（LP）やミリスチン酸イソプロピル（IPM）が適していると考えられた。
抗原タンパクは親水性で油に配合することは難しいが，親水性物質を配合できるW/OエマルションをLPまたはIPMを油相とし調製した。開発した基剤にFITC標識デキストラン（分子量4000，FD4）を配合し，Yucatan micropig皮膚に適用したところ，一部の処方で皮膚にFD4の蛍光が確認され，皮膚移行の可能性が示された。
当初の目的の1つである適切な基剤の開発については，予定通りの成果が得られたが，研究代表者の異動に伴い，進行がやや遅れ，本基剤を用いたヘアレスマウスを用いた感作性実験が行えなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
親水性高分子の配合が可能な基剤について，さらに処方の適正化を図る。その際には使用状況を踏まえたレオロジー的評価も行う。共焦点レーザー顕微鏡を用い，FITC標識デキストラン（分子量4000，FD4，分子量40000，FD40）のYMP皮膚への移行状況をリアルタイムで確認する。また，デキストランとタンパクでは分子量が同等でも形状や表面状態が異なるため，FITC標識OVAを用いて，FD4配合時と同様の検討を行い，有用性をYucatan micropig皮膚およびヘアレスマウス皮膚で確認する。その際に配合するアジュバンドの種類を作用メカニズムと配合性の両面から検討する。具体的には局所滞留性を高めるという点では，基剤自身にアジュバント作用がある可能性があるが，さらにアジュバント作用が確認できている酸化チタンを併用する。また，トールライクレセプターに作用するCpGは異なるメカニズムのアジュバントとなることから併用が有用である可能性がある。
遅れている感作性評価については，動物愛護の点からも適正に研究を進める。現在の処方について感作性を評価する。エマルション処方さらにアジュバントの添加などの適正化を行った後，感作性評価を行う。皮下注射と経皮投与を行い，OVA特異的IgEおよびIgGの血中濃度を測定することにより評価する。
今回検討する基剤はW/O型エマルションが主であり，処方中に水を含む。水を含まない製剤が開発できれば保存性がよくなるため，調製に水を使用しない，あるいは工程中で何らかの乾燥過程を組み入れることについても検討する。
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| Causes of Carryover |
基剤に関する検討はやや遅れたものの予定通りの成果が得られた。しかし，これに関する感作性評価の動物実験が年度内に行えなかったため，動物や測定用キットの購入予算を28年度に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
27年度の研究が計画よりもやや遅れたことが原因であるので，遅れた動物実験については28年度に繰り越した予算を用いて行う。また，28年度の研究は計画通りに進める予定であるので，28年度の経費は当初の申請通りとする。
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