腸上皮細胞間リンパ球（ＩＥＬ）による自己作用型ＤＮＡ断片化機構の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K08146
• Research Institution: Tohoku Fukushi University
• Principal Investigator: 伊藤 恒敏 東北福祉大学, 健康科学部, 教授 (90004746)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 尾形 雅君 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50311907)
• Project Period (FY): 2015-10-21 – 2018-03-31
• Keywords: IEL / 小腸 / マウス / DNA断片化 / DNA修復 / Granzyme B / Perforin

Outline of Annual Research Achievements

IELの機能解析を目的として、解析を行い、次のような報告をしてきた。
①マウスに抗CD3抗体を投与すると、30分後に十二指腸空腸のIECにDNA断片化が誘導され、2時間後にIECの剥離を伴う下痢が生じる。②抗体投与後のIECのDNA断片化はγδ型IELの活性化による。③IECの細胞剥離はTNFαにより誘導されるがDNA断片化は誘導しない。(Yaguchi et al., Cell Tissue Res., 2004)。④IECにDNA断片化が誘導されると、迅速にDNA修復関連分子が動員されDNA修復が行われる (Ogata et al., ibid., 2009)。⑤このDNA断片化はGranzyme B (GrB) 依存性で、Perforin (Pfn) 非依存性である（Ogata et al., ibid., 2013）。⑥γδ型IELは、抗CD3抗体に迅速に反応してGrBを放出し、その後絨毛内にとどまり、最終的に上皮組織内で死ぬことが確認された（一度だけの活性化＝disposable）(Ogata, ibid., 2014) 。
また活性化後のγδ型IELは、γδ型IEL自身のDNAも断片化する。細胞傷害性T細胞が自身のDNAも断片化するという報告はこれまでにない。さらにγδ型IELにおいてもIECと同様なDNA修復する現象がみられ、新規な「自己作用型DNA断片化」であることが確認された。
この新たな自己作用型DNA断片化機構の解明をすることで、γδ型IELの腸管局所生体防御上に果たす役割、その意義の解明が期待され、生体の小腸における生体防御の機構解明が大きく進展することが期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでの解析の結果、①抗CD3抗体をin vivo投与後、マウスの空腸絨毛では、IECのDNAが断片化されるのと同一の動態で、γδ型IELのDNA断片化が誘導されることが認められ、γδ型IELから放出されたGrBがγδ型IEL自身にも作用する「自己作用型の細胞傷害作用」であることが確認された。②IECと同様に、γδ型IEL でも一旦断片化したDNAの傷害部位にDNA修復分子が迅速に集積動員されDNA修復が行われることも明らかとなった。そして③このDNA断片化現象にもPfnは関与しない（Pfnによる先行的細胞膜穿孔は必要なし？）、など既報のDNA断片化とは異なるDNA断片化現象が判明した。
このIECおよびIELで観察された、Pfn「非」依存性のDNA断片化およびその後のDNA修復現象は、結果的に、生体での普遍的な現象であることが強く推察された。 (Ogata, Cell Tissue Res., 2015)

Strategy for Future Research Activity

今後の課題としては、①γδ型IELが細胞外に放出したGrBを穿孔分子（Pfn等）なしにγδ型IELの細胞内へ取り込む現象、②細胞穿孔なしにGrBを、細胞内に取り込む際に介在する分子の探索とその機序、の解明を目標に以下の研究を進めていく。
「細胞外に放出されたGrBのγδIEL細胞内への取り込みの検出と取り込み機序の解析」γδIEL刺激後、細胞外へ放出されたGrBは、どのように再度γδIEL細胞内に入るのかを検索。GrB作用後、断片化DNAが修復されるのでIECもγδIELも細胞は生きており、細胞膜は穿孔されていないと考えられる。取り込まれた後、GrBはいかにDNAまで到達するのか。
1. 刺激後のγδIEL細胞内に取り込まれたGrBの細胞内（in situ）検出：免疫組織学的検索による。 1-1. 抗体刺激前後でのGrBがγδIEL細胞内のどこに検出されるか。 1-2. 抗体刺激後のγδIELの核内にGrBが検出されるかどうか。
2. ex vivoでのγδIELによるGrB取り込み（Endocytosis）の解析。2-1. Percoll分離したIEL画分をCD103+とγδTCR+でGatingしたγδIELに蛍光標識GrBが取り込まれるかどうか、FACSで解析。 2-2. Endocytosis阻害剤による解析
Dynasore（Dynamin依存性Endocytosis阻害剤）、Wortmannin（Clathrin依存性Endocytosis阻害剤）、PXS25（MPR依存性Endocytosis阻害剤）等を使用：ex vivoで、各種阻害剤存在下、γδIELが蛍光標識GrBを取り込むかどうかの検索）

Causes of Carryover

10月に追加交付内定を受けたことより、研究計画を一部変更したため。
具体的には、当初初年度（平成27年度）に計画していたex vivoでの解析実験を、次年度（平成28年度）に実施することに計画変更を行った。但し、全体としての研究進捗状況についてはおおむね予定通りに進んでいる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初初年度（平成27年度）に計画していたex vivoでの解析実験を、次年度（平成28年度）に実施する。全体としての研究進捗状況についてはおおむね予定通りに進んでいる。