2017 Fiscal Year Research-status Report
細胞内マグネシウム恒常性維持におけるTRPM7チャネルの役割
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15K08188
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
田代 倫子 東京医科大学, 医学部, 講師 (20398762)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 華 東京医科大学, 医学部, 講師 (20390700)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 生理的Mgチャネル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心室筋細胞の生理的なMgイオンチャネルの同定を目指して、候補分子であるTRPM7の発現を抑制した細胞のMgイオン輸送能の測定を試みた。分子の発現抑制にはRNA干渉法を用いた。TRPM7のshRNA(small hairpin RNA)と共に導入の指標として蛍光蛋白質(GFP)遺伝子を持つ組換えアデノウイルス(rAdV)を作製し、成獣ラット心室筋の初代培養細胞に感染させた。72時間培養した後、TRPM7分子蛋白発現の抑制を確認するために、ホールセルパッチクランプ法によりTRPM7電流を測定した。非標的遺伝子のshRNAを組み込んだ細胞に比べてTRPM7電流の有意な低下を認めなかった。内在性TRPM7蛋白の発現が少ないこともあり、ウエスタンブロット法や免疫組織化学法による蛋白発現の抑制を確認できなかった。標本を再検討し、蛋白発現抑制が容易な細胞増殖能の高い株化細胞の使用を計画している。
平行してラット心室筋の急性単離細胞を用いて細胞内Mg濃度調節分子の薬理学的な解析を進めた。TRPM7はナルトリベンによって活性化され、NS8593によって抑制される。細胞を生理的な細胞外液で灌流中にナルトリベンを投与しても細胞内遊離Mgイオン濃度は上昇しないが、ナルトリベン投与と同時に細胞外Naイオンを除去するとMg濃度は上昇し、Naイオンの再添加で元に戻った。つまり、TRPM7の活性化によってMgイオンは流入するが、過剰なMgイオンはNa-Mg交換輸送によって汲み出されると考えられる。一方でNS8593は細胞外Naの有無に関係なく、わずかではあるが有意に細胞内Mg濃度を減少させた。細胞内Mg濃度が定常状態の時はNaに依存しないMgイオンの汲み出しが行われることを示唆する。この結果よりTRPM7によるMg流入が細胞内Mg恒常性維持に関与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
より生理的な細胞を標本にするため、成獣ラット心室筋初代培養細胞を用いたが、増殖能がなく培養日数も限られるため、内在性蛋白質の発現をRNA干渉法で抑制することが難しかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
標本を細胞増殖能の高い株化細胞に変更する。ラット心臓由来の筋芽細胞H9c2、マウス心房筋由来のHL1の使用を計画している。
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| Causes of Carryover |
論文執筆を次年度に延期したため。
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