2015 Fiscal Year Research-status Report
パーキンソン病関連タンパク質シヌクレインによる微小管制御の分子機構解明
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15K08282
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
鳥羽 栞 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (40419891)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 微小管重合制御 / 微小管結合タンパク質 / パーキンソン病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、パーキンソン病の遺伝的要因のひとつであり、またレビー小体型認知症との関連が疑われるシヌクレインタンパク質と微小管とのin vitroでの関連を中心に、主に電子顕微鏡を用いた観察を行った。シヌクレインは生体内で特別な構造をとらない不定形タンパク質とされている。本年度はそのシヌクレインに従来より予備実験を行っていた金コロイド標識に加えて、Halo-tag標識を結合させて微小管と混合し、電子顕微鏡の負染色観察、および標識を用いない急速凍結電子顕微鏡観察を行った。その結果、シヌクレインが微小管にリング状（または竹の節状）に巻きついているという特異な構造を発見できた。
さらに微小管との生化学的な特性を明らかにするために、シヌクレインと微小管の暗視野顕微鏡観察を行った。その結果、驚くべきことにシヌクレインは微小管の重合能力を促進し、通常より短い微小管を作り、さらに脱重合を抑制することがわかった。驚くべきことに、家族性パーキンソン病の変異を持つシヌクレインではこのような微小管の重合能力を制御する機能が失われていることまでわかった。
引き続き、シヌクレインのこのような微小管に対する特殊な生理学的役割をベースに、シヌクレインが細胞内輸送系においても重要な役割を果たしているという細胞生物学的実験につなげていくため、初代培養神経細胞系に蛍光標識シヌクレインを組み込んだ実験を進めている。さらに本研究を続けていくことにより、パーキンソン病発症の原因となる神経細胞死の鍵となるメカニズムの発見が期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画は、アルファシヌクレインの結合した微小管の動態解明であった。本年度はアルファシヌクレインだけではなく、シヌクレインファミリー全体、および、リン酸化状態のシヌクレイン、家族性パーキンソン病患者と同様の変異を持つシヌクレインを用いて、電子顕微鏡下で、微小管重合能力の違いを明確に観察できた。また計画通りにクライオ電子顕微鏡観察に成功し、標識などのアーティファクトのない状態でもシヌクレインが微小管にリング状（または竹の節状）に結合していることを確認できた。
ただし当初予定してたクライオ電子顕微鏡下の単粒子解析やらせん対称解析は、シヌクレイン分子の小ささ、および不定形性から困難と予想されるので、神経細胞内での微小管とシヌクレインの動態の観察に切り替えて準備を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述のように、微小管上のシヌクレインの構造をオングストロームレベルで明らかにするための電子顕微鏡を用いた単粒子解析やらせん対称解析は困難であることがわかった。ただし微小管を用いたクライオ電子顕微鏡解析から、微小管とシヌクレインの特別な相互作用が明らかになりつつある。微小管は生体内では通常１３本のプロトフィラメントから形成されるが、シヌクレインは微小管のプロトフィラメントの数を区別して結合してる可能性が見えてきた。引き続き、データ解析を続けて、シヌクレイン特異な微小管結合、制御能力を明らかにしていきたい。
さらにこれまでの実験はin vitroのものであったが、in vivoつまり神経細胞内でのシヌクレインと微小管の関係を神経細胞の超薄切片実験や免疫電顕から明らかにしていく予定である。
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| Causes of Carryover |
電子顕微鏡のグリッド使用料を５０万円ほど計上していたが、使用研究室より余剰グリッドの譲渡を受け、新規購入グリッドが不要となり、電子顕微鏡関係の消耗品費用がほとんどかからなかったため
また、旅費についてホテルでの滞在を計画していたが、相手先大学の施設を無料で使用できたため、ほとんど不要となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
費用があまりかからない電子顕微鏡の単粒子解析実験から、初代細胞培養を用いた生体試料の実験に切り替えるため、細胞や生体購入、維持に助成金を使用する
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