蛍光相関分光法による炎症関連転写因子活性定量プロファイル解析の臨床検査への展開

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K08612
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 北島 勲 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (50214797)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 仁井見 英樹 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 准教授 (50401865)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 先端検査デバイス / 転写因子 / 炎症 / 蛍光相関分光法 / 発現プロファイル / CAGE法

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、1分子レベルで高感度に物質量が定量できる蛍光相関分光法（FCS法）を基盤に、細胞内情報の集約機能を有する各転写因子活性量を定量化する検査法を確立し、本方法と細胞内分子を網羅的に解析する細胞発現アレイやCAGE法（CAP analysis gene expression)と比較検討することで遺伝子発現プロファイルの臨床応用開発を進めることである。本年度の実績は以下の通りである。１）転写因子NF-kappa BとAP-1活性化測定のためのプローブを選択し決定した。FCS測定は、MF20機器（オリンパス社）を利用し、定量化のための解析プログラムを開発した。２）NF-kappa Bに関する活性化プロファイル解析のために、IKK2ノックアウトマウスからIKK2欠損胎仔線維芽細胞（MEF)株を樹立した。
３）この細胞株の特性は、IL-1,TNFで刺激してもIL-6発現が抑制されており、IKK2-NF-kappa Bシグナルがブロックされていることが確認できた。４）IKK２欠損MEFと対照IKK２発現MEFをIL-1βで刺激し、サイトカインアレイを用いたサイトカイン発現プロファイル解析を行った。その結果、IKK2欠損MEFは対照に比して、エオタキシン1、IL-10, MCP-1の発現が上昇しておりTh２優位になっていることが明らかなった。今後、この細胞株を用いてTh2優位になっている理由をFCS法とともにDNA/転写因子発現プロファイルをTF-activation profiling plate arrayを用いた網羅的解析とCAGE法による網羅的遺伝子発現プロファイルと各遺伝子発現に関する転写因子開始点解析など新しい転写因子解析法を組み合わせて明らかにしてゆく計画である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成27年度はFCS測定機器であるMF20が施設耐震工事のため使用ができない状態であったが、平成28年度から順調に解析できる状態となり順調に解析が進められた。また本研究のテーマであるIKK-NF-κBシグナル系のプロファイル解析の精度向上のために利用する細胞としてIKK２ノックアウトマウスからIKK2遺伝子欠損細胞株を樹立できた。本細胞を利用してサイトカイン発現プロファイル解析による細胞特性が明らかになるなど臨床応用に向けて予定どおり順調に進展していると自己評価した。

Strategy for Future Research Activity

平成２８年度にIKK２-NF-κBシグナルに関する遺伝子発現プロファイル解析を行うためのIKK2欠損マウスとそのマウスから樹立したIKK2欠損MEF株を樹立した。また、このIKK2欠損マウスはアレルギー性皮膚炎を呈することが確認され、IKK2欠損MEFにおいてもTh２優位であることが明らかになった。平成29年度はマウス皮膚組織とMEFを用いて、MF20を利用したFCS法による転写因子定量とDNA/転写因子アレイ解析(TF-activation profiling array１, Signosis)とCAGE法による網羅的遺伝子発現と転写開始点解析を行い、アレルギー発症にかかわる転写因子と遺伝子発現プロファイル研究を進める計画である。

Causes of Carryover

おおむね順調に進んでいますが、物品購入の誤差が生じたため

Expenditure Plan for Carryover Budget

試薬購入

Research Products

• [Journal Article] SAD-B Phosphorylation of CAST Controls Active Zone Vesicle Recycling for Synaptic Depression. (2016)
  • Author(s): Mochida S, Hida Y, Tanifuji S, Hagiwara A, Hamada S, Abe M, Huan M1, Kitajima I, Sakimura K, Ohtsuka T
  • Journal Title: Cell Report Volume: 16 Pages: 1-13
  • DOI: doi.org/10.1016/j.celrep.2016.08020
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The active zone protein CAST regulates synaptic vesicle recycling and quantal size in the mouse hippocampus. (2016)
  • Author(s): Kobayashi S, Hida Y, Ishizaki H, Inoue E, Tanaka-Okamoto M, Yamasaki M, Miyazaki Fukaya M, Kitajima I, Yoshimi Takai Y, Watanabe M, Ohtsuka T, Manabe T
  • Journal Title: European Journal of Physiology Volume: 44 Pages: 2272-2284
  • DOI: doi: 10.1111/ejn.13331
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Melting Temperature (Tm) Mapping Method. A Novel Method for Rapid Identification of Unknown Pathogenic Microorganisms within Three Hours of Sample Collection. (2016)
  • Author(s): Sugie K, Ueno T, Niimi H, Hayashi S, Mori M, Yamamoto Y, Saito S, Kitajima I
  • Organizer: The 32nd World Congress of Biomedical laboratory Scinece
  • Place of Presentation: Kobe, JAPAN
  • Year and Date: 2016-08-30 – 2016-09-01
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Eukaryote-Made Taq Polymerase Enables Reliable Detection of Pathogens in Amniotic Fluid of Preterm Labor Cases-Development of a Novel Nested-PCR-Based Assay for Detecting Mycoplasma, Ureaplasma, other Bacteria and Fungi in Amniotic Fluid Samples. (2016)
  • Author(s): Ueno T, NiimiH, Yoneda N, Yoneda S, Mori M, Saito S, Kitajima I
  • Organizer: The 32nd World Congress of Biomedical laboratory Scinece
  • Place of Presentation: Kobe, JAPAN
  • Year and Date: 2016-08-30 – 2016-09-01
  • Int'l Joint Research