骨代謝におけるスフィンゴシン1リン酸レセプター3(S1P3)の働き

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09533
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 河野 正孝 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60405256)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川人 豊 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50336731) ; 中田 博 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90113141)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: スフィンゴシン1リン酸 / S1P3レセプター / 骨粗鬆症 / マウス卵巣摘出骨粗鬆症モデル

Outline of Annual Research Achievements

近年、骨代謝におけるS1Pシグナルが骨芽細胞、破骨細胞共において重要な役割を果たしていることが報告されているが、これらは主にS1P1,S1P2レセプターを介した報告であり、現在のところS1P3シグナルの骨代謝に果たす役割についてはほとんど解明されていない。
そこで我々は骨代謝におけるS1P－S1P3レセプターシグナルの働きを明らかにするために、マウス卵巣摘出骨粗鬆症モデルをS1P3ノックアウト（KO）マウス及び野生型マウスに作成した。C57BL/6マウスのF6世代S1P3+/-の雄及び雌を交配し生まれた野生型及びKOマウスを実験に用いた。第1日に麻酔下に卵巣を摘出(OVX)、またはsham手術を施行し第28日に屠殺、大腿骨を摘出し野生型及びKOマウスにおける骨密度を測定した。骨密度はOVX群（野生型：34.8±0.79, (n=8）vs KO：31.75±0.73(n=4), p=0.0065,マンホィットニーU検定）、 sham群（野生型：39.4±0.67,(n=4）vs KO：36.3±0.83(n=4), p=0.021,マンホィットニーU検定）と、ともにS1P3KOマウスで低下を認めていた。これはS1P3シグナルが健常状態及び低エストロゲン状況下のいずれの状態においても、骨代謝、特に骨形成に促進的に関与していることが示唆されるものである。
今後、S1P3の骨代謝への関与のメカニズムについて更なる検討を行う予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

骨密度測定に関しては検体数を増やすことで、実験結果の再確認を行っているところである。
また、組織の評価、蛋白やmRNAの発現を確認するため、ホルマリン固定標本及び凍結標本を集積している。
摘出した大腿骨をホルマリン固定しH&E染色で形態的な評価を行ったが、野生型およびKOマウスで明らかな変化を認めることはできなかった。
S1P3に対するポリクローナル抗体での免疫組織化学を施行し、その発現分布の検討を行ったが、現時点では安定した染色結果を得ることが出来ていない。
骨芽細胞におけるS1P3レセプターの発現と機能を検討するため、生後1週間以内のマウス頭蓋骨から骨芽細胞分化、確立を行った。
また破骨細胞におけるS1P3レセプターの発現と機能を検討するため、マウス骨髄より破骨細胞分化、確立を行った。

Strategy for Future Research Activity

骨の構造解析を行うためマイクロCTによる評価を予定している。
集積した組織における各種骨代謝関連因子（bFGF, LRP5, OPG, RANKL, Wnt1等）の発現を免疫組織化学で評価する。
確立した骨芽細胞および破骨細胞における骨代謝関連因子の発現，産生をELISA法、Western blot 法によりS1P3ノックアウト及び野生型マウスで比較・検討する。またS1P刺激による細胞増殖効果(WST-1法、cell count法)および細胞遊走能の検討を行う。