ゼブラフィッシュによる薬物の発生毒性評価 ～マウス・ラットとの比較～

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09713
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 坂田 ひろみ 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 准教授 (50294666)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福井 義浩 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (50144168) ; 澤田 和彦 つくば国際大学, 保健医療学部, 教授 (10284324)
• Project Period (FY): 2015-10-21 – 2018-03-31
• Keywords: ゼブラフィッシュ / 発生毒性 / エタノール / 5-HT神経 / アポトーシス

Outline of Annual Research Achievements

本研究は化学物質の発生毒性試験におけるゼブラフィッシュの有用性を検討することを目的としている。初年度である平成27年度は、ゼブラフィッシュ受精卵を種々の濃度のエタノールに曝露し、孵化後の稚魚を用いて外表形態の観察、ホールマウント免疫染色、ホールマウントin situハイブリダイゼーション、および定量的RT-PCRを行い、エタノールがゼブラフィッシュの発達に及ぼす影響について検証した。その結果、2％エタノール曝露群では、飼育過程で死滅する受精卵の割合がものが多く、得られた稚魚には単眼など外表奇形を有する個体が複数含まれていた。1%エタノール曝露群では、卵の多くが自力で孵化し、稚魚に目立った外表奇形は認められなかった。1％エタノール曝露群の稚魚を用いた解析では、アポトーシス関連遺伝子である casp3とp53は対照群に比べて発現量が多い傾向にあったが、有意な差は見られなかった。セロトニン (5-HT)関連遺伝子であるFEVとTPHRの発現量については、対象群との間に大きな差は認められなかった。 さらにホールマウントin situ ハイブリダイゼーションにより5-HT合成酵素遺伝子（5-HT細胞のマーカー）の局在、及びホールマウント免疫染色により5-HT神経細胞の局在を観察したところ、対照群、1％エタノール群ともに中脳縫線核で発現が認められたが、その局在や発現量については群間で大きな差がなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ゼブラフィッシュ受精卵を種々の濃度のエタノールに曝露し、孵化後の稚魚を用いて外表形態の観察、ホールマウント免疫染色、ホールマウントin situハイブリダイゼーション、および定量的RT-PCRを行うことにより、エタノールがゼブラフィッシュの発達に及ぼす影響について検証した。ゼブラフィッシュ受精卵を受精後5時間 (5 hpf)から1~3% (v/v)のエタノールに曝露し、孵化までの様子を観察した。3%エタノール群は30 hpfまでにすべての受精卵が死滅した。2％エタノール群でも死滅する受精卵の割合が多く、生存した受精卵中の稚魚も自力孵化が困難だった。そのため、60hpfまで孵化できなかった受精卵は人為的に卵殻を破り、稚魚を採取したが、得られた稚魚には単眼または両眼球が近接するなど、外表奇形を有する個体が複数含まれていた。1%エタノール群では、卵の多くが自力で孵化し、稚魚に目立った外表奇形は認められなかった。1%エタノール群の稚魚（55 hpf）からRNAを採取し、各種遺伝子の発現量を解析したところ、アポトーシス関連遺伝子(casp3及びp53)は対照群に比べ発現量が多い傾向にあったが、有意差はなかった。また、5-HT神経関連遺伝子(FEV及びTPHR)の発現量も対照群との間に有意な差はなかった。 さらに5-HT合成酵素遺伝子の局在、及び5-HTの局在を観察したところ、対照群と1％エタノール群の両群で中脳縫線核に強い陽性反応が認められ、群間に大きな差はなかった。以上の通り、本年度はエタノール曝露モデルを優先して作製し、その解析を行いながら、他の薬剤の曝露モデルの作製にも取り組んだ。研究全体の遅延を回避するため、先に得られたエタノール曝露モデルでは平成28年度及び29年度に行う予定としていた内容の一部(ホールマウントin situハイブリダイゼーションと定理定量的RT-PCR)も実施した。よって、研究全体としては大幅な遅れもなく、順調に研究が進められていると思われる。

Strategy for Future Research Activity

研究代表者である坂田は本年４月に徳島大学から金沢医科大学に転出したが、新たな所属先も本研究を継続するための設備（共焦点レーザー顕微鏡、定量的PCR装置、DNAマイクロアレイ装置など）を有している。また、ゼブラフィッシュ飼育装置は、徳島大学から無償貸与される予定である。よって今後も本研究が計画通りに進められる環境にある。今後も研究分担者である福井、澤田と蜜に連絡を取りながら研究を進めていく予定である。平成27年度は発達期エタノール曝露ゼブラフィッシュモデルの作製と解析を主に行った。2%エタノール曝露モデルでは単眼の個体が得られるなど、これまで種々の動物を用いて行われてきた発達期エタノール曝露実験と一致した所見が再現することができた。一方で、アポトーシスは5-HT神経系発生に対しては、明確な影響を確認することができなかった。発達期エタノール曝露ではアポトーシスの亢進や5-HT神経系の発達障害が複数の動物種で報告されているため、解析個体数を増やしたり実験手法の改善を行うことでアポトーシスや5-HT神経系発生に対する影響もゼブラフィッシュで検出できるか否かを検討したい。また、平成28年度は、継続してホールマウント免疫染色、ホールマウントin situハイブリダイゼーション、及び定量的RT-PCRにより、種々の分子や遺伝子の発現量や局在の解析を行うが、それに加えてDNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現変化の網羅的解析を行う予定である。また、現在作製に取り組んでいる発達期バルプロ酸、レチノイン酸、またはMAM曝露ゼブラフィッシュモデルでも同様の解析を進めていく予定である。

Causes of Carryover

交付決定が年度後半であったため、購入希望物品の納入が間に合わなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成28年度に使用予定物品を購入し、実験予定である。