2016 Fiscal Year Research-status Report
腫瘍特異性の高い放射線増感剤の開発－メトフォルミンを用いた胃癌細胞での検討－
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15K10008
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
茂松 直之 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (30178868)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
深田 淳一 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (50338159)
川田 哲也 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (60234077)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 胃癌 / 放射線照射 / メトフォルミン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に引き続き、ヒト由来胃癌細胞（MKN_45、MKN_74）に対して放射線照射/メトフォルミン投与/両者の併用投与を行い、24-72時間後に細胞を回収し、細胞生存率、アポトーシス誘導、細胞周期の変化について検討した。昨年度の検討より照射線量は4.0Gy、メトフォルミン投与量は25mMとした。アポトーシスを示す細胞分画の比率については、アネキシンV抗体/PI（ヨウ化プロピジウム）試薬を用いてフローサイトメトリーで測定した。照射、メトフォルミン投与いずれにおいても早期アポトーシス、後期アポトーシス分画両群の増加が認められた。同時投与群では、早期アポトーシス群の増加がより顕著であった。MKN_74における1例として、コントロール、照射単独、メトフォルミン投与単独、同時投与の４群でそれぞれ 16.5、30.7、29.6、40.4%であった。
細胞周期の変化を前述と同様の４群で検討した。その結果、照射群と併用投与でG1細胞の比率低下、G2細胞の比率上昇が見られた。メトフォルミン投与単独におけるG2比率はコントロールと同等ないしは軽度低下傾向であった。照射とメトフォルミン投与併用後、48時間後に回収した群で細胞死を示唆するsubG1細胞が最も多く観察された。
まとめとして、照射とメトフォルミン投与による生存率、アポトーシス誘導と細胞周期の変化について測定した。本年度は両者を投与することアポトーシス分画の明らかな増加を観察することができた。細胞周期の検討では、照射がG2ブロックを起こすのに対し、メトフォルミンはG１ブロックを誘導することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト胃癌細胞セルラインを用いたフローサイトメトリー法による細胞周期測定においては、本年度は、放射線照射/メトフォルミン投与/両者の併用投与のいずれにおいても、細胞周期の変化を観察することができた。特に照射と薬剤が異なる細胞周期において細胞周期を停止していることが推測されており、照射抵抗性細胞に対するメトフォルミン投与の有効性が期待された。同じくフローサイトメトリー法によるアネキシンV抗体/ヨウ化プロピジウムを用いたアポトーシス分画の検出においても、本年度は放射線照射/メトフォルミン投与/両者の併用投与によるアポトーシス細胞比率の増加を確認することができた。一方、当初予定していたPI3K/mTOR阻害剤との比較やヒト線維芽細胞を用いた正常細胞との比較は、手技を簡略化するためいったん省略して実験を遂行した。
全体として、昨年度明らかにできなかった放射線照射/メトフォルミン投与/両者の併用投与による①細胞周期の変化、②アポトーシスの誘導について、フローサイトメトリー法を用いて細胞応答の違いや同時投与による有効性を明らかにすることができた。以上より当初予定した実験をすべて終了していないものの一定の成果を挙げており、おおむね順調であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、これまでに行ってきた①細胞周期の変化の観察、②アポトーシスの誘導についてPI3K/mTOR阻害剤との比較や正常細胞との比較としてヒト線維芽細胞を用いることでより有用な結果が得られるようにする。手法についてはフローサイトメトリー法を継続して細胞応答を測定する。さらに①については、細胞周期関連因子についてチェックポイント因子発現の変化をWestern blot 法、免疫染色法などで精査することでキーとなるタンパク発現について探索、特定する。これに加えて、前年度遂行できなかったメトフォルミンの抗腫瘍効果の機序とされている③AMPK活性及びPI3K-Akt-mTOR経路の活性測定を行う。メトフォルミンによる照射抵抗性の改善、照射の増感効果について検討するために、照射単独、薬剤単独、照射と薬剤の併用それぞれについて、上記経路の活性度をWestern blot 法、免疫染色法を応用することで評価する。放射線抵抗性についても、④がん幹細胞マーカー（表面マーカー）の放射線照射/メトフォルミン投与/両者の併用投与前後の発現比率についてフローサイトメトリー法で測定することで、別の角度からの検証を行いたい。
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| Causes of Carryover |
未使用額の発生は効率的に物品調達を行った結果である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額と合算して有効な物品購入に充当する。
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