Development of cultured skin which has tolerance in ischemia.

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K10036
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 猪口 貞樹 東海大学, 医学部, 教授 (60160008)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 椎名 隆 東海大学, 医学部, 准教授 (00317744) ; 安藤 潔 東海大学, 医学部, 教授 (70176014) ; 平山 令明 東海大学, 先進生命科学研究所, 教授 (70238393)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ヒト皮膚由来細胞 / HIF-1α / PHD阻害剤 / 遺伝子発現 / 再生医療

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、DMOG、新規PHD阻害剤TM6008によるヒト表皮細胞（NHK）、真皮線維芽細胞（HDF）の遺伝子発現・分泌の変化を確認し、これらで処理した細胞の移植実験を行った。
【方法】①NHK、HDFをDMOG100microMに6～24時間暴露し、RPL5遺伝子をリファレンスにしたq-PCRによる下流遺伝子の相対発現比、培地中の分泌蛋白定量を反復した。②TM6008を塩酸化と両性溶媒の添加により可溶化し、同様に遺伝子発現とVEGFAの分泌を確認した。③DMOG、TM6008で処理したHDFと正常NHKを混合して免疫不全マウス皮下に移植し、再生された皮膚を病理組織学的に検討した。④PHD阻害剤の細胞障害性をMTT法で確認した。
【結果】①DMOGの添加により、NHK、HDFいずれもBNIP3、EGLN1(PHD2)、VEGFの相対発現比が有意に増加、VEGFの分泌速度はHDFで大幅に増加した。CXCL12、SDF1はHDFで相対発現比が低下、IGFBP3はNHKで増加したが、分泌蛋白は検出感度以下であった。②TM6008の添加によるVEGFの相対発現比はHDFでやや増加、NHKでやや低下したが有意ではなく、VEGFの分泌速度は増加しなかった。③DMOG処理細胞の免疫不全マウス皮下移植後における結節形成率は約20%と低く、病理組織学的に再生表皮の剥離脱落が見られた。TM6008処理細胞は生着しなかった。④TM6008の48時間暴露で明らかな細胞障害性が見られたが、DMOGの細胞障害性は軽微であった。
【考案】DMOGによりHDFでのVEGFの発現・分泌が大幅に増加することが確認された。一方、移植実験からDMOG,TM6008はex vivoで用いると表皮再生を阻害する可能性があり、移植時全身投与や低用量長期局所投与などの異なるアプローチを検討する必要があると思われた。