胆汁分泌小胞中miRNAの解析による胆管癌の早期診断マーカーの開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10194
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 竹村 茂一 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (00322363)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 南山 幸子 京都府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (00362989) ; 久保 正二 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (80221224)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 胆道癌 / 胆汁 / 印刷業 / バイオマーカー

Outline of Annual Research Achievements

肝胆膵癌においてERCPや術中に採取した胆汁のレドックス動態、脂質過酸化物等を測定するとともに患者（印刷業含む）胆汁中の細胞外小胞中のmiRNAを解析しこれらを組み合わせることによって独自の早期診断マーカーを探索し、予後不良の胆管癌の減少に貢献することを目的とする。
初年度は、印刷従事者胆管癌4例、印刷業以外の肝胆膵癌43例、非担癌症例14例から採取した胆汁について酸化還元動態、変異原性試験、胆汁酸組成を検討した。印刷業事業者とそれ以外の胆管癌をHPLC法により電気化学検出器（クーロケム）で検出した結果を比較すると印刷業で酸化型グルタチオンの割合が高く、組成では二次胆汁酸が多いことが判明した。印刷業の胆管癌は発癌時点ではすでに有機溶剤暴露中止から長期間経過しているため薬剤の影響は考えにくく、病理組織像を勘案すると薬剤により過去に惹起された胆管炎の遷延化を反映した結果と考えられた。全症例において変異原性試験は陰性であった。
胆道癌症例及び非胆道癌症例より術中に採取した胆汁を用いてエクソソームの回収を試みた。胆汁中のmiRNAは微量であり通常のRNAシークエンサー法では困難であった。現在、胆汁250μlをシステムバイオサイエンス社のExoQuick Exosome Precipitation Solutionを用いてExosomeの精製を行った。得られたExosome分画をカンタムデザイン社NanoSightを用いて、粒子の分散・凝集の確認、経時観察による安定性の確認、そして形状の判断を行った。その結果、正常者、肝胆癌患者いずれの胆汁からも粒子径が120 nm前後で、1 X e^12　個/mlの粒子が得られExosomeが精製できたと判断した。次に、これらExosome分画からのmiRNAの分離を試みたが現在のところ収量が低く別の手段を講じることを検討している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成27年度予定していた肝胆膵担癌患者における胆汁のレドックス動態をHPLCーECDで解析は概ね順調に集積でき、解析もできている。印刷業従事者を含む胆道癌症例及び非担癌症例ともに変異原性試験を施行したが、UMU試験の結果全例陰性であった。胆道癌の新たなバイオマーカーを検出するための胆汁中のエクソソームの解析は、予想された通りごく微量であるためその精製は困難であったが、やっとその手法を確立できた。現在、エクソソーム中のmiRNAの分離を試みている。

Strategy for Future Research Activity

当初予定した胆道癌の特異性の高いバイオマーカーを検出するために考案した胆汁を用いた解析法のうち、酸化ストレス関連の検討ならびに変異原性試験については順当に終了しつつある。胆汁中のmiRNAの解析に関して従来困難であった胆汁中のエクソソームの精製法を確立したので、エクソソーム分画からのmiRNAの収量を高める手法を考案、得られたmiRNAプロファイルより胆道癌特異的な変動を見いだしたい。

Causes of Carryover

物品費で翌年度への繰り越しが生じた理由として研究計画の一部において解析のための条件検討に時間がかかったため必要な試薬の発注が遅れたためです。

Expenditure Plan for Carryover Budget

現在、上記研究計画の一部における解析方法の確立ができたため、本年度には多数例の検討を必要とするため消耗品費が増加するため、予定通りすべての物品費が必要となる予定です。

Research Products

• [Journal Article] Pathological spectrum of bile duct lesions from chronic bile duct injury to invasive cholangiocarcinoma corresponding to bile duct imaging findings of occupational cholangiocarcinoma. (2016)
  • Author(s): Kinoshita M, Kubo S, Nakanuma Y, Sato Y, Takemura S, Tanaka S, Hamano G, Ito T, Terajima H, Yamada T, Nakamori S, Arimoto A, Fujikawa M, Sugawara Y, Yamamoto T, Abue M, Nakagawa K, Unno M, Mizuguchi T, Takenaka K, Shirabe K, Shibata T.
  • Journal Title: J Hepatobiliary Pancreat Sci. Volume: 23 Pages: 92-101
  • DOI: 002/jhbp.305
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Screening and surveillance for occupational cholangiocarcinoma in workers exposed to organic solvents. (2016)
  • Author(s): Kubo S, Takemura S, Tanaka S, Nishioka T, Kinoshita M, Hamano G, Ito T, Yamamoto T, Abue M, Aoki M, Nakagawa K, Hijioka S, Miyamoto A, Osaki Y, Endo G, Kumagai S.
  • Journal Title: Surg Today. Volume: 46 Pages: 705-712
  • DOI: 10.1007/s00595-015-1229-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] MicroRNA expression in hepatocellular carcinoma after the eradication of chronic hepatitis virus C infection using interferon therapy. (2016)
  • Author(s): Tamori A, Murakami Y, Kubo S, Itami S, Uchida-Kobayashi S, Morikawa H, Enomoto M, Takemura S, Tanahashi T, Taguchi YH, Kawada N.
  • Journal Title: Hepatol Res. Volume: 46 Pages: 26-35
  • DOI: 10.1111/hepr.12518.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Therapeutic administration of an ingredient of aged-garlic extracts, S-allyl cysteine resolves liver fibrosis established by carbon tetrachloride in rats. (2015)
  • Author(s): Kodai S,Takemura S, Kubo S, Azuma H, Minamiya Y
  • Journal Title: Journal Clinical Biochemistry and Nutrition Volume: 56 Pages: 179-185
  • DOI: 10.3164/jcbn.14-108.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Management of hepatitis B virus infection during treatment for hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma. (2015)
  • Author(s): Kubo S, Takemura S, Tanaka S, Shinkawa H, Nishioka T, Nozawa A, Kinoshita M, Hamano G, Ito T, Urata Y
  • Journal Title: World Journal of Gastroenterology Volume: 21 Pages: 8249-8255
  • DOI: 10.3748/wjg.v21.i27.8249.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cytoglobin Deficiency Promotes Liver Cancer Development from Hepatosteatosis through Activation of the Oxidative Stress Pathway. (2015)
  • Author(s): Thuy le TT, Matsumoto Y, Thuy TT, Hai H, Suoh M, Urahara Y, Motoyama H, Fujii H, Tamori A, Kubo S, Takemura S, Morita T, Yoshizato K, Kawada N
  • Journal Title: The American Journal of Pathology Volume: 185 Pages: 1045-1060
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2014.12.017.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Do patients with small solitary hepatocellular carcinomas without macroscopically vascular invasion require anatomic resection? Propensity score analysis (2015)
  • Author(s): Hirokawa F, Kubo S, Nagano H, Nakai T, Kaibori M, Hayashi M, Takemura S, Wada H, Nakata Y, Matsui K, Ishizaki M, Uchiyama K.
  • Journal Title: Surgery Volume: 157 Pages: 27-36
  • DOI: 10.1016/j.surg.2014.06.080.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 印刷会社で集団発生した胆管癌の最近の知見 Ⅱ 職業性胆管癌症例の臨床的特徴 (2015)
  • Author(s): 久保正二，竹村茂一，田中肖吾，木下正彦，濱野玄弥，伊藤得路，青田尚哲，江田将樹，中沼安二，圓藤吟史
  • Journal Title: 産業医学レビュー Volume: 28 Pages: 139-146
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 職業性胆管癌の病態とその特徴 (2015)
  • Author(s): 久保正二，竹村茂一，田中肖吾，新川寛二，木下正彦，濱野玄弥，伊藤得路，青田尚哲，江田将樹，佐藤保則，中沼安二
  • Journal Title: 肝胆膵 Volume: 71 Pages: 877-885
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 当科における職業性胆管癌切除症例の病理学的検討 (2015)
  • Author(s): 木下正彦，中沼安二，竹村茂一，佐藤保則，田中肖吾，新川寛二，西岡孝芳，濱野玄弥，伊藤得路，青田尚哲，江田将樹，久保正二
  • Organizer: 第13回日本消化器外科学会大会
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル新高輪（東京都港区）
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-10
• [Presentation] Carbon monoxide releasing molecule-3 (CORM-3) modulates progression of M1/M2 phenotypes in alveolar macrophages (2015)
  • Author(s): Yamamoto-Oka H, Mizuguchi S, Toda M,Izumi N, Okada S, Minamiyama Y,Takemura S, Cerpinskas G, Nishiyama N
  • Organizer: SFRR-E/SNFS Meeting Stuttgart 2015
  • Place of Presentation: シュトゥットガルト（ドイツ）
  • Year and Date: 2015-09-02 – 2015-09-04
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Liver fibrosis is improved by treatment of S-allyl cysteine, an aged-garlic extract, in CCl4-treated rats (2015)
  • Author(s): Minamiyama Y, Takemura S, Kodai S, Kubo S, Mizuguchi S, Oka-Yamamoto H, Ichikawa H, Yoshikawa T
  • Organizer: SFRR-E/SNFS Meeting Stuttgart 2015
  • Place of Presentation: シュトゥットガルト（ドイツ）
  • Year and Date: 2015-09-02 – 2015-09-04
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 肝内胆管癌の病態に立脚した治療戦略の現状 (2015)
  • Author(s): 竹村茂一，上西崇弘，田中肖吾，久保正二
  • Organizer: 第51回日本肝癌研究会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-07-23 – 2015-07-24
• [Presentation] Local control of Laparoscopic hepatic resection for surface hepatocellular carcinoma: Comparison with percutaneous radiofrequency ablation (2015)
  • Author(s): Ito T, Tanaka S, Iwai S, Takemura S, Hagihara A, Uchida S, Sakae M, Hamano G, Kinoshita M, Koda M, Aota T, Kawada N, Kubo S
  • Organizer: The 6th Asia-Pacific Primary Liver Cancer Expert Meeting
  • Place of Presentation: ハイアットリージェンシー大阪（大阪府大阪市）
  • Year and Date: 2015-07-03 – 2015-07-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Dissolution of liver fibrosis by S-allyl cysteine, an aged-garlic extract, in CC14-treated rats. (2015)
  • Author(s): Minamiyama Y, Takemura S, Kodai S, Kubo S, Azuma H, Osada-Oka M, Misumi K, Terao J, Ichikawa H
  • Organizer: 12th Asian Congress of Nutrition
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2015-05-14 – 2015-05-18
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] これまでの職業性胆管癌症例の検討-大阪での１７例と新規労災認定９例の比較- (2015)
  • Author(s): 木下正彦，中沼安二，竹村茂一，田中肖吾，新川寛二，西岡孝芳，濱野玄弥，伊藤得路，江田将樹，久保正二
  • Organizer: 第115回日本外科学会定期学術集会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場(愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-04-16 – 2015-04-18