iPS細胞から誘導した気管支肺胞幹細胞は障害肺の修復を加速させる

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10260
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 鳥羽 博明 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 助教 (40403745)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 先山 正二 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 准教授 (60291986) [Withdrawn] ; 川上 行奎 徳島大学, 大学病院, 特任講師 (00596249)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: iPS細胞 / 気管支肺胞幹細胞 / 終末細気管支障害 / 急性肺障害 / 気道内投与

Outline of Annual Research Achievements

まず，目的の細胞ソースである気管支肺胞幹細胞(BASCs)の単離から行った．Driscollらのプロトコール(Method Mol Biol)に準じてマウス肺からの原始細胞の採取を行い，手技はおおよそ確立することができ，マウス1匹あたりから約1.0×106個の原子細胞を安定して採取することができるようになった．さらに目的の細胞であるBASCsをFACSにてソーティングし，Sca-1(+)/CD31(-)/CD45(+)の細胞群であるBASCsの回収を行った．プロトコールによると通常1.02%程度のBASCsを回収することができると報告されているが，われわれは0.7-1.0%程度のBASCsを回収でき，ほぼ再現性の高い結果を得ることができた．さらに，回収したBASCsと思われる細胞群に対して，CCSP/Sftpcの免疫染色を用いてvalidationを行うために，セルブロックを作成した．回収したBASCsをマウスの気管内に投与するための投与経路としてマウスの気管切開を行い，極細径のチューブを留置することにも成功し，気管切開の術後も安定した生存を得ることができた．次いで，Naphthalene誘導終末細気管支障害モデルの作成を試みた．8-12週齢のB6マウスにNaphthaleneを200㎎/kgを腹腔内投与し，経時的に観察し，投与後2日目でH-E染色で終末細気管支領域の気道上皮細胞が広汎に脱落し，気道上皮の障害を確認することができ，その後投与7・14日目と経時的に修復されてくることを確認した．同時にマウスiPS細胞からのBASCsへの分化・増殖に関しても取り組んでいる途中で，現時点ではフィーダー細胞を使用してマウスiPS細胞の増殖・分化を経時的に確認しつつ，条件設定を行っている段階である．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

マウス肺からの気管支肺胞幹細胞(BASCs)の単離，障害マウスモデルの作成は順調に進んでいる．しかしながら，終末細気管支障害モデルへのBASCsの投与による生着を確認するまでには現時点では至っていない．BASCsが生体肺内でかなり少ないpopulationであること，また障害モデルへの気管内投与の手技確立に時間がかかることが要因として挙げられる．同時に進めているマウスiPS細胞からのBASCsの分化・誘導に関しては，これまで当教室ではiPS細胞の取り扱い経験がなかったため，手技を習得し，実践するのにかなりの時間を要したことが要因として挙げられる．

Strategy for Future Research Activity

本年度に達成できていない終末細気管支障害モデルへのマウスから単離したBASCsの投与の準備段階はすでに整っており，本年度は速やかに実験計画の遂行に移すことができると考えている．さらにはマウスiPS細胞からのBASCSへの誘導はpreliminalyな結果を得つつあり，さらに手技の安定した確立を目指して鋭意進める予定である．前述した手技を確立することができれば，本年度予定している実験計画にもスムーズに移行できると考えている．

Causes of Carryover

iPS細胞の取り扱い経験がなかったため，手技を習得し，実践するのにかなりの時間を要したため.

Expenditure Plan for Carryover Budget

未使用額の使用用途については，特にiPS細胞の培養や誘導にはさまざまな試薬が必要であり，使用させていただく予定である．