2016 Fiscal Year Research-status Report
無細胞化神経へのシュワン細胞付加法としての端側神経縫合の実用性
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15K10949
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
林 礼人 順天堂大学, 医学部, 先任准教授 (10365645)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水野 博司 順天堂大学, 医学部, 教授 (80343606)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 端側神経縫合 / 神経移植 / 神経再生 / シュワン細胞 / 人工神経 / 脂肪組織由来幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は本研究費の助成を得て端側神経縫合法が無細胞化神経(acellular nerve allograft; ANA)へのシュワン細胞供給方法になりえないかと考え基礎研究を行っている。
ANAに対する端側神経縫合を用いたシュワン細胞付加が有用であることはこれまでの研究で明らかになってきたが、シュワン細胞がANA内へ遊走するのに十分な期間やシュワン細胞を充填する移植神経の長さの限界などの課題が残存した。そのため、移植神経2本を端々縫合で連結して2cm長にし、端側神経縫合するモデルを加えた。その際に両側のみを端側神経縫合するモデルと、移植神経中央を側々縫合し、3個所の神経縫合を加えるモデルを作成し、ANA内へのシュワン細胞遊走範囲や遊走関連蛋白の変化などの多角的な検証を試みた。しかし、移植神経の長さを2cmとした群において、安定したモデル作成に難渋し、モデルの手技間による誤差が大きく、評価困難であった。
一方、本手技の実用性を検討するために、他の臨床応用可能な手技として神経再生に有効とされている脂肪組織由来幹細胞(Adipose-derived stem cells; ASCs)を移植した群と比較した。ANAへのASCs移植方法として、同種のラットより採取した下腹部脂肪組織よりASCsを作成し、ANAに直接注入を行った。マウスではASCsを移植する手技の誤差が大きかったため、実験動物種としてラットを用いた。ラットの坐骨神経に欠損を作成し、欠損部位に15mmの①未処理のANA（コントロール群）、②我々が今まで研究してきた両側端側神経縫合を用いて、4週間シュワン細胞を遊走させたANA、③ASCsを5×105個を局注したANA を移植した3群を作成し、移植4週間後の軸索や神経関連蛋白、運動機能等に関して評価を行っている段階である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
2本連結の両側端側神経縫合および側々神経縫合群におけるNestin-GFPマウスモデルでのシュワン細胞遊走の評価が出来ていない。昨年度、Nestin-GFPマウスにおいて片側の坐骨神経に3ヶ所神経縫合する場合、遠位側の神経縫合部位が坐骨神経から分枝した後の細い神経に移植神経の遠位端を神経縫合しなければならず、口径差が存在してしまう点、シュワン細胞をANA内へ遊走させる期間で移植神経が、皮下で折れ曲がりながら留置しているため、評価する際の剥離作業中に損傷する可能性が高い点が問題であり、安定したモデル作成が困難であった。その改善策として、両側の坐骨神経を架橋する様に2本連結のANAを移植するモデルを作成した。しかし、手術侵襲が大きいため、観察期間が経過する前にほとんどの個体が死亡した。依然として、安定した手術手技の確立が困難であった。
そこでもう一つの目標である他の臨床応用可能な手技との比較に重点をおき、神経再生に有効とされているASCs移植した群との比較を行うこととした。実験動物種としてマウスを用いる予定であったが、マウスのANAの神経上膜がASCsの注入による圧力により破綻するため、モデル作成が困難であった。ラットのANAの神経上膜はASCsを注入しても破綻しなかったため、ラットを実験動物種とし、検討を行っている段階である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度は初年度及び昨年度の遅れを取り戻すために、前述の3群に対して軸索再生能力や神経関連蛋白の発現の度合、運動機能の差異を検討する。
また、昨年度困難であったマウスにおけるASCs移植群の手術手技を安定させ、軸索再生の効果をより明確に確認するために、軸索全てが蛍光発色するThy-1-YFP16マウスに坐骨神経欠損を作成し、それぞれの移植神経を欠損部へ10mmの長さで神経移植し評価を行う。
同時に2本連結の両側端側神経縫合および側々神経縫合群のモデルの確立を並行して行い、安定した手術手技が確立できた場合は各群の端側神経縫合長期群（6週、8週）モデルによる無細胞化神経内へのシュワン細胞遊走範囲や関連蛋白の遺伝子発現量の変化などの得られた結果から適切な各々の端側神経縫合における無細胞化神経内へのシュワン細胞遊走期間を設定する。
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| Causes of Carryover |
購入予定であった抗体・試薬が実験の遅れなどの理由から使用量が少なくなった。
次年度にまとめて購入・使用する方が抗体・試薬の使用期限の観点から望ましいと考えた。また、現在軌道に乗り始めた別のプロジェクトも存在するため次年度で追加購入する必要があるため望ましいと考えた。そのため、物品費において、使用予定経費として計上した220,000円の内104,955円のみ使用したため生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験に必要な抗体や試薬、縫合糸などの購入が必要になることが予想されるため、それらの物品購入に使用する予定である。
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