2015 Fiscal Year Research-status Report
細胞溶解毒素遺伝子の伝搬とその発現による口腔連鎖球菌の病原性化機構
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15K11012
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
長宗 秀明 徳島大学, ソシオテクノサイエンス研究部, 教授 (40189163)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
友安 俊文 徳島大学, ソシオテクノサイエンス研究部, 准教授 (20323404)
田端 厚之 徳島大学, ソシオテクノサイエンス研究部, 助教 (10432767)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 口腔連鎖球菌 / 細胞溶解毒素 / 溶血毒素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々が解析した、あるいはデータバンクに公開された口腔連鎖球菌のアンギノーサス群（AGS）とミチス-肺炎球菌群（MGS）の各菌種/亜菌種のゲノムを系統的に比較解析した結果、これらの菌群の内、溶血性を示す菌株群から幾つか新規の溶血毒素/細胞溶解毒素の候補遺伝子が見出された。大別してMGSにはコレステロール依存性細胞溶解毒素（CDC）が、AGSにはストレプトリシンS類縁毒素（SLS）が多く分布していた。これらの候補遺伝子をPCRクローニングし、S. infantisで見出されたCDCについては大腸菌で組換え体を発現・精製し、その特性を解析した。SLSについては不安定なペプチド性因子で組換え体の精製が困難なことから、これを発現する菌株での遺伝子欠失と相補の実験により、その機能を解析した。その結果、S. infantisのCDCは細胞膜タンパク質とコレステロールの２つを受容体とするヒト細胞指向性の動物種依存的溶血活性を示し、また興味深い事に酸性pHでより強い活性を示した。またこのCDCをヒト口腔扁平上皮癌細胞に作用させると細胞死が誘導されることも確認された。次に、既に報告した2亜菌種以外のAGSの2亜菌種（S. anginosus subsp. whileyiとS. constellatus subsp. viborgensis）において見出されたSLS候補遺伝子を欠失させると、その株の溶血性は消失し、遺伝子相補すると溶血性が回復した。さらにヒト口腔扁平上皮癌細胞に対し、それらの野生株、欠失変異株、相補株によるin vitro感染実験を行った結果、SLS依存的に顕著な細胞毒性が確認された。これらの結果から、今回解析した候補遺伝子産物は、実際にその菌種/亜菌種の溶血活性や細胞毒性を担う毒素であることが確認され、それを生産するAGSやMGSの病原因子となることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通りに口腔連鎖球菌のアンギノーサス群（AGS）とミチス-肺炎球菌群（MGS）の各菌種/亜菌種におけるゲノムの比較解析を行った結果、これら菌群に属する溶血性の菌株群から機能が未解析の５種の溶血毒素/細胞溶解毒素候補遺伝子が見出され、その過半数については各遺伝子産物の溶血活性の確認やその作用特性、またin vitroでの細胞感染実験などからヒト培養細胞に対する毒性などについても明らかにすることができた。しかしまだ未解析の遺伝子があることから、さらにこれらの解析を継続することが必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
①昨年度までに見出された新規の溶血毒素/細胞溶解毒素（HL）候補遺伝子の内、まだ解析ができていないものについては、機能確認や病原性への寄与について解析を引き続き実施する。
②これまでの解析から、S. mitis（SM）では、HL遺伝子をゲノムの特定の遺伝子座に持つ病原性の高い菌株群とHL遺伝子を持たない菌株群が菌種内に存在することから、同一菌種/菌群の株間でのHL遺伝子の伝搬によって、同一菌種内で病原性の異なる株が生じている可能性が指摘されている。従って先ずSMにおいて、抗生物質A及びB（適切なものを選択する）に感受性を示すHL保有株と非保有株の、前者にはAに、後者にはBに対する耐性遺伝子をそれぞれ導入して混合培養し、抗生物質A感受性で抗生物質B耐性を示す溶血性株の出現を観察して、菌株間でのHL遺伝子伝搬性の有無を検討する。この検討を、昨年度までに解析されたHL保有性が不均一な他のミチス-肺炎球菌群（MGS）やアンギノーサス群（AGS）の菌種についても同様に行う。
③次に②でHL遺伝子の受容株が得られた場合については、ゲノム上での各HL遺伝子の挿入位置やその周囲の遺伝子配座を親株と比較して遺伝子伝搬機構を検討する。またHL遺伝子受容株とその親株の病原性も、前年度と同様に比較解析して、HL遺伝子の伝搬と病原性の変化の関連性を解析する。
④ところでこれまでの検討結果からは、S. intermediusの例外を除くAGSにおいてはストレプトリシンS類縁毒素が、MGSにおいてはコレステロール依存性細胞溶解毒素がそれぞれ分布していることから、これらの菌群をまたいだHL遺伝子の伝搬は起こっていない可能性が高まってきている。しかし菌群をまたいだHL遺伝子の伝搬の可能性ついても、③でHLの遺伝子伝搬が見られたAGSやMGSの菌種があった場合には、それらの菌種を用いて検討していきたい。
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| Causes of Carryover |
第８９回日本細菌学会総会が年度末にあり、出張旅費の支払いが平成２８年４月になることから、その支出に不足にならない額を残すために次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記の出張旅費は４月に支払いが完了する予定であり、それを差し引いた残額は次年度の消耗品費に繰り込み、次年度計画実施のために使用する。
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