2015 Fiscal Year Research-status Report
Runx2のGalnt3発現制御を介したリン代謝調節の生理的意義の検証
| Project/Area Number |
15K11016
|
|---|
| Research Institution | Nagasaki University |
|---|
Principal Investigator |
六反田 賢 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (60549608)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | Runx2 / Galnt3 / FGF23 / 高リン血症 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
血中のリン濃度は主に、FGF23によって調節される。FGF23 は、主に骨から産生されるホルモンで、腎臓の近位尿細管でリン再吸収を抑制する。さらに、活性型ビタミンDの産生量を抑制、小腸でのカルシウム、リンの吸収を抑制する。したがって、尿細管でのリン再吸収抑制と合わせ、血中リン濃度を低下させる。Galnt3（UDP-N-アセチル-D-ガラクトサミン:ポリペプチド N-アセチル-D-ガラクトサミン転移酵素 3）は、セリンやスレオニンの水酸基にN-アセチルガラクトサミンを付加し、O-グリカンを形成する。すなわち、ムチン型糖鎖形成の第一ステップを担う酵素である。FGF23にムチン型糖鎖を付加し、FGF23のプロセッシングを阻害して活性を維持する作用が明らかにされている。ヒトでのGalnt3の異常は、FGF23のプロセッシングが促進され、FGF23の活性が低下、家族性高リン血症性腫瘍状石灰沈着症を引き起こす。Runx2は骨芽細胞分化および軟骨細胞後期分化に必須な転写因子である。Runx2が転写調節するターゲット遺伝子をマイクロアレイで検索した結果、Galnt3がRunx2によって、骨芽細胞でも軟骨細胞でも発現誘導されることを見いだした。Runx2が直接Galnt3遺伝子を制御するか解析した。Galnt3遺伝子の転写開始点より上流3kbのDNA断片をクローニングし、ルシフェラーゼベクターに挿入、レポーターアッセイを施行した。Runx2は、レポーター活性を増強した。また、塩基配列に変異を導入することにより、Runx2結合配列を特定した。さらにRunx2抗体を用いたChIPアッセイで、同領域でのRux2の結合を検出した。これらの結果により、Runx2がGalnt3遺伝子を直接転写調節することが明らかとなった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
レポーターアッセイおよびChIPアッセイで、Runx2がGalnt3遺伝子を直接転写調節することを明らかにできた。また、塩基配列に変異を導入することにより、Galnt3プロモーターにおけるRunx2の結合配列も明らかにできた。Runx2 floxマウスを2.3 kb Col1a1プロモーターCreトランスジェニック（tg）マウスと交配し、Runx2 flox/flox Cre (Runx2fl/fl Cre)マウスも作製した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
Runx2fl/fl Creマウスおよび2.3 kb Col1a1プロモーターを用いた骨芽細胞特異的Runx2 tgマウス、Galnt3 ノックアウト（ko）マウスの血中Ca, Pを測定するとともに、 ELISA法を用いてintact FGF23を測定する。また、頭蓋冠、長管骨、下顎骨よりRNAを抽出、リアルタイムRT-PCRで、Galnt3 mRNA, FGF23 mRNAを測定する。
骨芽細胞特異的Runx2 tgマウスでは、免疫組織染色で、Galnt3の発現を野生型マウスと比較し、骨芽細胞特異的にGalnt3発現が増強しているか調べる。
Runx2fl/fl CreマウスとGalnt3 koマウスの血中P, intact FGF23を比較し、Runx2によるGalnt3発現制御が、血中P, intact FGF23の維持に、生理的にどの程度寄与しているか明らかにする。
マイクロCTを用いて、Runx2fl/fl CreマウスおよびGalnt3 koマウスの骨量、海綿骨の数、厚さを比較する。また、皮質骨の厚さ、内骨膜周囲長、外骨膜周囲長を計測する。骨組織形態計測で、骨量、骨芽細胞数、類骨面、類骨幅、破骨細胞数、吸収面、石灰化速度、骨形成率を計測する。Goland-Yoshiki法で類骨染色を行い、石灰化の促進があるか検討する。骨形成マーカーとして血清オステオカルシン、骨吸収マーカーとしてTRAP5bを測定する。骨芽細胞分画を用いて、Galnt3, FGF23, Runx2, Sp7, Col1a1, オステオポンチン、骨シアロ蛋白、Rankl, Opgを、骨細胞分画用いて、Galnt3, FGF23, Sost, DMP1, FGF23, Phex, Mepe, Rankl, Opgの発現をリアルタイムRT-PCRで調べる。
|
| Causes of Carryover |
Runx2 flox/flox Cre(Runx2fl/fl Cre)マウスの作成過程で、マウスの繁殖が悪かったため、維持費が安くなり、３６４０円が繰り越しとなった。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
試薬として、アイソジェン、逆転写酵素、Real Time PCR関連試薬、カスタムオリゴ、アガロース、Galnt3抗体、FGF23抗体、Ca、P測定キット、FGF23測定ELISA、TRAP5b測定キット、オステオカルシン測定キットなどを購入する。: 513,640円
プラスチック器具購入：100千円、マウス購入：100千円、マウス維持費： 25千円/月x 12ヶ月＝300千円、 国内旅費：日本歯科基礎医学会（札幌）での発表 90千円、 海外旅費：（28年度）米国骨代謝学会での発表 200千円
|
-
[Journal Article] Cbfb regulates bone development by stabilizing Runx family proteins.2015
Author(s)
Qin X, Jiang Q, Matsuo Y, Kawane T, Komori H, Moriishi T, Taniuchi I, Ito K, Kawai Y, Rokutanda S, Izumi S, Komori T.
-
Journal Title
Journal of bone and mineral research
Volume: 30
Pages: 706-714
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
-
[Presentation] Cbfb plays important roles in bone development through the stabilization of Run family proteins.2015
Author(s)
2.Qin X,Jiang Q,Matsuo Y,Kawane T,Komori H,Moriishi T,Taniuchi I, Ito K,Kawai Y,Rokutanda S,Izumi S, Komori T
Organizer
The RUNX Transcription Factors in Development and Disease
Place of Presentation
Weizmann Institute of Science, Israel
Year and Date
2015-10-18 – 2015-10-21
Int'l Joint Research
-
