重症複合型免疫不全を呈する希少難病（細網異形成症）の病態解明と治療法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11072
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 野間 隆文 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 教授 (40189428)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 谷村 綾子 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 助教 (10610199) ; 堀口 大吾 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 助教 (70304532)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 重症複合型免疫不全症 / 細網異形成症 / AK2 / 遺伝子変異 / エネルギー代謝 / 細胞分化 / 組織特異的遺伝子発現

Outline of Annual Research Achievements

細網異形成症（RD）の原因として，ミトコンドリア酵素であるAK2遺伝子変異が報告されているものの，その発症機序については不明のままである。RDでは，免疫細胞の分化障害が病態の基盤になっており，その発症機序を明らかにするためには，T細胞分化におけるAK2の役割の解明が必要であると考えている。一方，制御性T細胞（Treg）については，解糖系を阻害するとnaive T細胞からTregの分化誘導が促進されることから，酸化的リン酸化によるエネルギー代謝がTregの分化誘導に重要な役割を担っている。今年度は誘導型Foxp3発現ベクターを安定的に保持するJurkat細胞株を取得するために，１.リポソームによる遺伝子導入法，２．Nucleofectionによる遺伝子導入法をそれぞれ独立して実験した。
１．リポソームによる遺伝子導入
Jurkat細胞への誘導型Foxp3発現ベクターの遺伝子導入は， TransIT-JurkatおよびX-tremeGENE-HPを用いて行った。その結果，この２種類のリポソームを用いたリポフェクション法では，GFP発現ベクターのトランスフェクション後24時間でのGFPの発現細胞の割合を計測した結果から，遺伝子導入効率は，せいぜい1%前後であった。outgrowthしてくるクローンはいずれの実験条件でも得られなかった。
２．Nucleofectionによる遺伝子導入
Jurkat細胞にベクターとpuromycin耐性遺伝子を20:１で, co-nucleofectionした。クローニングは96-well plateに1細胞ずつ蒔いた。その結果，30 well以上で増殖する細胞クローンとして樹立された。現在，各クローンの細胞増殖を待って，保存とDoxycyclinによるFoxp3の発現誘導能を確認する実験の準備中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度の目標は，昨年度達成できなかった課題である安定的FoxP3発現誘導細胞株の樹立である。まず昨年度の方法論を再検討し，FoxP3発現誘導ベクターの遺伝子導入において，改善すべき点として，導入効率の改善が明らかになった。通常のリポフェクション法と電気穿孔法（Nucleofection）の２つの方法のうち，リポフェクション法はNucleofection 法に比べて，T細胞株であるJurkat細胞への遺伝子導入効率が極端に低いことが分かった。この点を踏まえて，FoxP3発現誘導ベクターの遺伝子導入をNucleofection 法を用いた。さらに，細胞がPuromycinに感受性が高いことが分かったので、これを考慮して，Nucleofection後の細胞の回復期間を２種類用意するとともに，薬剤選択期間を設定した。このような実験条件の検討を踏まえて、現在クローンが３０以上選抜することができ，Doxycyclinによる誘導活性の検討に入っている。研究計画全体ではやや遅れが見られるものの，改善の効果が認められており、着実な進展を認めている

Strategy for Future Research Activity

２９年度は，取得できたクローンの分析と誘導活性が高いクローンの選抜により，Treg細胞分化誘導時のAK2の役割の検討を予定している。

Causes of Carryover

Treg誘導後のAK2の遺伝子発現抑制下での実験が29年度に繰り越されたため、それに必要な試薬の購入を29年度にまわしたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究費の一部（3万円）を平成29年度に使用する。