2015 Fiscal Year Research-status Report
新規低酸素誘導性初期化遺伝子GLIS1機能解析および診断・治療法開発研究
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15K11252
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
谷本 圭司 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 助教 (90335688)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | hypoxia / 低酸素 / 細胞分化 / 転写制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
iPS細胞誘導において，新たな細胞初期化因子として証明されたGLIS1ですが，その制御・機能は全く明らかにされていません。そこで，この細胞初期化を促進する転写因子GLI-similar 1（GLIS1）の詳細な制御機構，分子機能，そして，口腔がんにおける機能的・臨床的意義について検討し，がん診断・治療法開発への応用展開することを目的として，本申請研究を開始しました。
初年度は，口腔がん細胞株HSC2に加え，乳がん細胞株MDA-MB-231にGLIS1発現プラスミドベクターを遺伝子安定導入を試みました。まず，MDA-MB-231に３ラインの導入株が得られたので，細胞機能に関しての予備的な実験を開始しました。MDA-MB-231のGLIS1強制発現株では対照株に比べて，細胞増殖能は明らかに抑制されたが，創傷治癒実験による遊走能は明らかに増加していた。一方，ノンコーティング培養皿を用いた培養により，Sphere形成能が向上している様子が観察された。現在は，HSC2細胞に加え，肺がん細胞株A549も用いて導入細胞株を作製中であり，結果の再現性，普遍性を確認予定である。一方，口腔がん，肺がん，乳がん細胞株に5azaC処理後にGLIS1遺伝子発現解析を行った結果，幾つかの細胞株では，明らかな発現増加を認めました。これらの結果は，GLIS1遺伝子発現がDNAメチル化により抑制されている可能性を示唆するものであり，プロモーター解析とともに，比較検討を進めています。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
GLIS1強制発現細胞によるGLIS1機能解析はHSC2細胞では細胞作製に手間取ってはいますが，先に出来上がったMDA-MB-231において，明らかな細胞機能が表現型として観察されたことから，今後の解析にも期待が持たれます。また，GLIS1発現制御に関しても，DNAメチル化による発現抑制の可能性を示唆する結果を得たことから，今後の解析も，自信を持って進められます。一方，HIF-2とAP-1の相互作用の解析において，市販の抗体での解析が成功しないため予定通り進められていません。そこで，ゲノム編集技術を用いて，HIF2A（EPAS1）遺伝子の3'領域にGFPタグを挿入した細胞を作製しました。これにより内在性のHIF-2aタンパクがGFP融合タンパクとして発現し，IPなどの抗体使用実験も安定的に利用可能な抗GFP抗体を用いた実験が可能となります。初年度中に細胞株が作製できたため，次年度の解析に期待が持たれます。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は，引き続き，GLIS1導入株の作製，およびそれらを用いた細胞生物学的および生化学的解析，網羅的遺伝子発現解析を進めます。また，ゲノム編集によりGFPタグを挿入したHIF-2aを用いて，AP-1（JUNやFOS）との相互作用に関して，生化学的な解析を行います。さらに，GLIS1遺伝子のシークエンスやメチル化解析を進め，geneticやepigeneticな異常が見いだされた場合，将来的な臨床検体を用いた解析へ向けて，ハイスループットに解析する方法の開発を試みます。低コストなmutation-specific PCR，PCR-RFLPやmethylation-specific PCR法やprobe-based real-time PCR法などが候補となります。そして，HIF-2αやAP-1阻害剤による，HIF-2αとAP-1の機能変化，GLIS1発現変化，GLIS1発現と細胞応答（増殖，遊走，コロニー形成，薬剤感受性など）の関連性を比較検討し，治療法開発への応用展開の可能性を探ります
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Research Products
(5 results)
