ペプチド核酸を応用した選択的細菌抑制による微生物叢コントロール法の確立

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11404
• Research Institution: Osaka Dental University
• Principal Investigator: 前田 博史 大阪歯科大学, 歯学部, 教授 (00274001)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 苔口 進 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (10144776) ; 高柴 正悟 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (50226768) ; 北松 瑞生 近畿大学, 理工学部, 講師 (60379716)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: アンチセンス / 歯周病原細菌 / HSP60 / 口腔細菌叢

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的はアンチセンスPNAを口腔微生物に対して応用し，病原遺伝子の発現抑制，あるいは特定細菌種の増殖抑制を行うことである。これによってアンチセンスPNAを応用した細菌叢コントロール法を開発するための基礎を確立する。これまでの研究から、アンチセンスPNAを効率よく細菌（Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans）菌体内へ導入するためのペプチド配列を同定することができた。平成27年度はこのペプチド配列を応用した研究を実施し、以下の研究結果を得た。
１．歯周病原細菌P. gingivalis、ならびにA. actinomycetemcomitansのHSP60遺伝子を標的としてアンチセンス配列の設計を行った。
２．設計したアンチセンス配列をもとにPNAを合成し、これに菌体導入の効率を上げるためのペプチド配列（KFFKFFKFFK）、ならびに蛍光物質（Tmr-red）を付加したアンチHSP60PNAを合成した。
３．合成したアンチセンスPNAをP. gingivalis、ならびにA. actinomycetemcomitansの培養液中に添加し、菌体内導入効率を調べた。その結果、ペプチド（KFFKFFKFFK）単体に比べ、導入効率は低下するものの、菌体内へアンチセンスPNAが導入されていることを確認することができた。
４．標的遺伝子としたHSP60の発現を調べた結果、アンチセンスPNAによる発現抑制は顕著ではなく、今後、標的配列、ならびに標的遺伝子の変更が必要となる可能性がでてきた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

設計したアンチセンスPNAを歯周病原細菌に導入することができた。残念ながら、効果的に標的とした遺伝子の発現抑制を行うことはできなかったが、今後、標的とする配列を変更すること、あるいは標的遺伝子を変更することで問題を解決できるものと考える。

Strategy for Future Research Activity

発現抑制を行う標的遺伝子を複数設定し、それぞれの遺伝子に対するアンチセンスPNAを可能な限り多く準備したうえで、導入試験と遺伝子の発現抑制試験を行う。予算の制約はあるが、合成した複数のアンチセンスPNAの中から、効率よく標的遺伝子の発現を抑制するものをスクリーニングする方策をとる。

Causes of Carryover

平成27年度の予算使用額が予定額を29,154円下回った。これは、価格キャンペーン時を活用して物品費を低価格に抑えた結果である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本年度の研究結果から、アンチセンスPNAの標的遺伝子配列の候補を増やす必要性がでてきた。予算はこのPNA作成のための予算に充足して使用する。

Research Products

• [Journal Article] Effect of glucose concentrations on the pH and growth of Streptococcus mutans and Porphyromonas gingivalis (2015)
  • Author(s): Yamawaki Isao, Taguchi Yoichiro, Kato Hirohito, Okuda Makiko, Katayama Nobuhito, Hashimoto Naoki, Shida Munenori, Nishikawa Ikuo, Tamura Isao, Miyake Tatsuro, Maeda Hiroshi, Umeda Makoto
  • Journal Title: 日本歯科保存学雑誌 Volume: 58 Pages: 510-517
  • DOI: 10.11471 / shikahozon.58.510
  • Peer Reviewed / Open Access