• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2017 Fiscal Year Annual Research Report

Development of novel method for generation of genome editing mice without ex vivo handling of embryos

Research Project

Project/Area Number 15K14371
Research InstitutionTokai University

Principal Investigator

大塚 正人  東海大学, 医学部, 准教授 (90372945)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 和田 健太  東京農業大学, 生物産業学部, 准教授 (20508113)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywordsゲノム編集 / マウス / CRISPR / エレクトロポレーション / in vivo / i-GONAD
Outline of Annual Research Achievements

2017年度は、GONAD法のさらなる改良と応用性の拡張を進めた。得られた結果は以下のとおりである。
前年度までに、Cas9はmRNAではなくタンパク質を用いた方がゲノム編集効率が良い結果を得ていたが(i-GONAD法と命名)、今回はCas9だけでなくCpf1タンパク質を用いたゲノム編集にも挑戦した。標的遺伝子はチロシナーゼ(Tyr)とHprtである。その結果、両遺伝子座ともに高効率でゲノム編集が可能であることがわかった。
我々はこれまでに、長い1本鎖DNAをドナーとして用いることで高効率にノックインマウスを作製することが可能なEasi-CRISPR法を独自に開発したが、これがi-GONAD法に応用できれば同手法の汎用性の向上につながる。そこで、i-GONAD法に使用するために大量のssDNAをivTRT法で調製し、内在性遺伝子座位へのレポーター遺伝子の挿入を目指した。その結果、Pitx3座位で15%(5/34)、Tis21座位で7%(1/14)の効率でノックインに成功した。これらの正確なノックイン個体外にも、不正確に配列が挿入されている個体や標的領域にindelが生じている個体も確認され、それらを統合すると、Pitx3座位で62%(21/34)、Tis21座位で36%(5/14)がゲノム編集個体であった。本実験結果により、i-GONADを用いてノックインマウスが作製可能であることが示された。
さらに、国内(東海大)で4回のデモンストレーションを実施し、他大学/研究所の14研究室から来られた計21人の学生、研究者、技術職員に向けて講習を行った。また、海外でのワークショップは2回(ドイツ、アメリカ)で実施し、30以上の大学、研究所、企業から参加した多数の参加者に向けた講習を行った。
本実績はGenome Biology誌にて発表した。

  • Research Products

    (20 results)

All 2018 2017 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (2 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (14 results) (of which Int'l Joint Research: 6 results,  Invited: 6 results) Remarks (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results)

  • [Int'l Joint Research] University of Nebraska, Medical Center(米国)

    • Country Name
      U.S.A.
    • Counterpart Institution
      University of Nebraska, Medical Center
  • [Int'l Joint Research] Georg-August-University Gottingen(Germany)

    • Country Name
      Germany
    • Counterpart Institution
      Georg-August-University Gottingen
  • [Journal Article] Successful production of genome-edited rats by the rGONAD method2018

    • Author(s)
      Kobayashi T, Namba M, Koyano T, Fukushima M, Sato M, Ohtsuka M, Matsuyama M.
    • Journal Title

      BMC Biotechnol

      Volume: 18 Pages: 19

    • DOI

      10.1186/s12896-018-0430-5

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases2018

    • Author(s)
      Ohtsuka Masato、Sato Masahiro、Miura Hiromi、Takabayashi Shuji、Matsuyama Makoto、Koyano Takayuki、Arifin Naomi、Nakamura Shingo、Wada Kenta、Gurumurthy Channabasavaiah B.
    • Journal Title

      Genome Biology

      Volume: 19 Pages: 25

    • DOI

      10.1186/s13059-018-1400-x

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] ex vivo胚操作が不要なゲノム編集動物作製法「GONAD」の開発とラットへの応用を目指して2018

    • Author(s)
      大塚正人
    • Organizer
      第11回ラットリソースリサーチ研究会
    • Invited
  • [Presentation] i-GONAD: A Method for Genome Editing Rodents without ex vivo Handling of Embryos2018

    • Author(s)
      Ohtsuka M
    • Organizer
      New Frontiers in CRISPR-based Gene Editing (Part of the 25th International Molecular Medicine Tri-Conference)
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 採卵、顕微注入、胚移植のステップが不要なゲノム編集マウス作製法GONADによるノックインマウス作製2017

    • Author(s)
      大塚 正人, 三浦 浩美, 佐藤 正宏
    • Organizer
      日本ゲノム編集学会第2回大会
  • [Presentation] Rescue of the albino phenotype in mice using GONAD method2017

    • Author(s)
      Hiromi Miura, Naomi Arifin, Masahiro Sato, Masato Ohtsuka
    • Organizer
      International Pigment Cell Conference 2017(IPCC2017)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Development of a mouse model suitable for in vivo genome editing efficiency studies2017

    • Author(s)
      Hiromi Miura, Yutaka Inagaki,Channabasavaiah B Gurumurthy, Masahiro Sato, Masato Ohtsuka
    • Organizer
      14th Transgenic Technology Meeting (TT2017)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Improved GONAD (i-GONAD) (I) as ex vivo manipulation-free genome-editing system allowing efficient knock-out, large deletion, and knock-in2017

    • Author(s)
      Masato Ohtsuka, Hiromi Miura, Channabasavaiah B. Gurumurthy, Masahiro Sato
    • Organizer
      14th Transgenic Technology Meeting (TT2017)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Improved GONAD (i-GONAD) (II): usefulness of rhodamine-dextran for monitoring the success of the GONAD and of gonadotrophin-based regulation of the timing for the GONAD2017

    • Author(s)
      Masahiro Sato, Shingo Nakamura, Channabasavaiah B. Gurumurthy, Satoshi Watanabe, Masato Ohtsuka
    • Organizer
      14th Transgenic Technology Meeting (TT2017)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 新たなゲノム編集技術GONAD法を用いた遺伝子改変ラットの作製法2017

    • Author(s)
      小林 朋絵、難波 真澄、古家野 孝行、佐藤 正宏、大塚 正人、松山 誠
    • Organizer
      第40回日本分子生物学会年会
  • [Presentation] 簡便なゲノム編集マウス作製法GONAD法を用いたアルビノマウスのレスキュー実験2017

    • Author(s)
      高林 秀次、青島 拓也、佐藤 正宏、大塚 正人
    • Organizer
      第40回日本分子生物学会年会
  • [Presentation] In vivoゲノム編集効率評価系モデルマウスの開発2017

    • Author(s)
      三浦 浩美、稲垣 豊、佐藤 正宏、大塚 正人
    • Organizer
      第40回日本分子生物学会年会
  • [Presentation] GONAD: a simple method to generate genome-edited mice without ex vivo handling of embryos. Mouse genome engineering2017

    • Author(s)
      Ohtsuka M
    • Organizer
      Mouse genome engineering in EMBO Practical Course
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 遺伝子改変マウス作製の簡便化を実現する新しい手法: GONAD(Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery)法2017

    • Author(s)
      大塚正人
    • Organizer
      徳島大学「ゲノム編集事業」キックオフシンポジウム
    • Invited
  • [Presentation] 新規遺伝子改変マウス作製方法:PITT, Easi-CRISPR, GONAD2017

    • Author(s)
      大塚正人
    • Organizer
      第3回川島カンファレンス
    • Invited
  • [Presentation] GONAD: ex vivo胚操作を要しないゲノム編集マウス作製手法2017

    • Author(s)
      大塚正人
    • Organizer
      第40回日本分子生物学会年会 ランチョンセミナー
    • Invited
  • [Remarks]

    • URL

      http://masato2.wixsite.com/ohtsuka-lab

  • [Patent(Industrial Property Rights)] 哺乳動物の受精卵に物質を導入する方法2017

    • Inventor(s)
      大塚 正人、森泉 俊幸、森泉 康裕
    • Industrial Property Rights Holder
      株式会社ベックス、学校法人東海大学
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      2017-233100

URL: 

Published: 2018-12-17   Modified: 2022-06-07  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi