Construction of E. coli expression system for eukaryotic membrane proteins

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K14475
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 今井 友也 京都大学, 生存圏研究所, 准教授 (90509142)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石水 毅 立命館大学, 生命科学部, 准教授 (30314355) ; 中島 啓介 沖縄科学技術大学院大学, マリンゲノミックスユニット, 研究員 (10422924)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 膜タンパク質 / 真核生物 / ホスファチジルコリン / 大腸菌発現系

Outline of Annual Research Achievements

真核生物の細胞膜はホスファチジルコリン（PC）を主成分として含む。一方で異種発現系によく使われる大腸菌の細胞膜の主成分はホスファチジルエタノールアミン（PE）であり、PCを全く含まない。膜タンパク質の機能や構造は、周囲の脂質分子に影響を受けることが報告されていることから、大腸菌のPEをPCへ変換して膜脂質環境を真核生物的にすることで、真核生物の膜タンパク質を大腸菌で発現できる可能性を調査した。
大腸菌の脂質組成のPCリッチへの改変は、前年度と同じくNMT（N-メチル基転移酵素）遺伝子を導入することで行った。
前年度に引き続き、モデル膜タンパク質として、①酢酸菌（バクテリアとして珍しくPCを含む）のセルロース合成酵素複合体；②植物由来のGalAT；③接合藻類のセルロース合成酵素（CesA)；④植物のマンナン合成酵素（CslA)の発現実験を行った。さらに今年度は⑤ホヤのCesAについても発現系を構築して発現実験を行った。
酢酸菌のセルロース合成酵素複合体については前年度に実験行ったCesABではなく、もう2つのサブユニットCesCとCesDも含めた４タンパク質の共発現系を使い実験を行った。PC変換にともない各サブユニットの発現パターンに変化が現れたことは確認できたが、その変化を統一的に説明することは難しいようだった。
また植物GalAT、植物CslA、ホヤCesAについては、試した限りの条件では発現を確認することは出来なかった。一方で接合藻CesAについてはPC産生大腸菌で特異的に発現する様子が一度認められたが、再現性が得られなかった。再現性が得られなかった原因を特定できれば、本法を確立させるための重要な情報となると考えられる。