2015 Fiscal Year Research-status Report
木材腐朽菌を用いたヒト型糖タンパク質生産用プラットフォームの開発
| Project/Area Number |
15K14771
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
本田 与一 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (70252517)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中沢 威人 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (80608141)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 担子菌 / 組換え体 / タンパク質発現 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
コレラトキシンＢサブユニットをコードする遺伝子断片をヒラタケの構成的遺伝子sdi1プロモーターおよび菌体外分泌タンパク質MnP2のシグナル配列下流に連結した発現プラスミドを作成し、カルボキシン耐性マーカープラスミド共に、野生型ヒラタケに形質転換導入を行った。カルボキシン耐性を指標として形質転換体を単離し、ＰＣＲによってコレラトキシンＢサブユニットコード配列の導入について確認を行い、複数の遺伝子組換え株を単離した。これらの株をふすま入りの液体培地中で振蕩培養を行って、菌体外に分泌されるタンパク質の解析を試みたが、期待される組換えタンパク質を著量に発現している株は見つからなかった。一方で、糖タンパク質の糖鎖解析の指標として、MnP2のアミノ酸置換変異体の生産を、上記の系と同一の系により行い、菌体外に変異型酵素を生産していると考えられる株を複数単離することに成功した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
異種発現はまだ成果を見ていないものの、対照として用いた担子菌由来のタンパク質発現では、組換え系が順調に働いていることが確認されているため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
異種タンパク質の発現系では、タグを用いるなどすることで、微量の発現であってもウェスタン解析等で検出可能な系に改良を施し、ヒラタケによる異種糖タンパク質発現を実施して、精製および糖鎖の解析へと進む。
|
| Causes of Carryover |
本年は、異種糖タンパク質の生産がうまくいかず、これを精製する際に用いる予定であった凍結乾燥機の購入に至らなかったため。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
異種糖タンパク質が発現したら、精製と糖鎖解析のため、凍結乾燥機を購入し使用する予定である。
|
