魚類の卵母細胞を標的とする分子輸送体を産生するトランスジェニックメダカの作製

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14797
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 平松 尚志 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 准教授 (10443920)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 分子輸送 / バイオリアクター / 卵 / ビテロジェニン / メダカ / 生物工学

Outline of Annual Research Achievements

本研究の最終目的は、卵に特異的に発現する受容体を標的として、親魚から卵・仔魚へ世代を超えて様々な有効物質を輸送することのできる、分子輸送システムを開発することである。試験期間内の到達目標は、遺伝子組換え技術によるモデル分子輸送体の生体内生産に挑戦し、将来的に同輸送体を大量生産する生物工場（バイオリアクター）開発に向けた萌芽的技術基盤を得ることである。H27年度は、卵への輸送を担う分子として、卵黄蛋白質前駆体ビテロジェニンの一部領域（リポビテリン重鎖領域：LvH; Lv軽鎖領域：LvL）を設定し、以下の成果を得た。
・遺伝子組換え魚飼育および同作製試験に必要な設備を整備すると共に、モデル魚であるメダカ受精卵への遺伝子導入に必要な条件（飼育条件・マイクロキャピラリーの作製条件等）を最適化した。
・発現および輸送性状の可視化を可能にするため、赤色蛍光蛋白質（DsRed）キメラ輸送体をコードする発現ベクターコンストラクトを作製した。即ち、魚類における遺伝子組換え個体の作製に実績のある強制発現ベクター2種（pCAGGSおよびpT2AL200R150G）を選択し、インサートとしてLvHまたはLvLにDsRedを融合した計3種のコンストラクト（pCAGGS/LvH/DsRed, pT2AL200R150G/LvH/DsRed, pT2AL200R150G/LvL/DsRed）を作製した。
・これら発現コンストラクトを導入した培養細胞（COS1）を作製し、各組換えキメラ輸送体を一過性発現させた結果、コンストラクト導入細胞は赤色蛍光を示し、機能的なコンストラクト蛋白質の発現が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度であるH27年度の目標である遺伝子導入に向けた準備（組換え魚の飼育・作製試験設備整備・作製条件の検討・導入コンストラクトの作製等）がほぼ終了したため、「おおむね順調に進展している」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、上記3種の蛍光キメラ輸送体を発現する初世代（F0）遺伝子組換えメダカを作製し、野生型との戻し交配により第1（F1)世代、続いてF1同士交配による第2（F2)世代の作出を試みると共に、発現した蛍光キメラ輸送体の卵への輸送性状を生化学的・組織学的に解析する。
蛍光キメラ輸送体の輸送能が確認でき、輸送能を持つビテロジェニン部位が特定できた後に、蛍光蛋白質部位をアビジン（Av）に置き換えたモデル輸送体インサート（LvH/Av, LvL/Av）を含むコンストラクトを作製し、上記と同様な手法で組換えメダカを作製するとともに、蛋白質として発現したコンストラクトの生化学的性状解析（分子サイズの確認、ビオチン標識物質との結合等）を行う。