2015 Fiscal Year Research-status Report
転写抑制とテロメア長短縮に寄与するTLS蛋白質-非コード核酸相互作用の解析
| Project/Area Number |
15K18485
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
近藤 敬子 京都大学, エネルギー理工学研究所, 研究員 (00707474)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | NMR / TLS/FUS / タンパク質-核酸相互作用 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
TLSタンパク質は、Cyclin D1 遺伝子のプロモーター領域から転写される非コードRNAと結合することにより、CREP結合たんぱく質およびp300のヒストンアセチル転移活性を阻害し、Cyclin D1 遺伝子の転写を抑制する。この非コードRNAから見出された30 nt程のTLS結合領域について、NMR法によって二次構造を解析した。その結果、5’側は１本鎖であり、3’側にG-U塩基対を含むステムループ構造を持つことが明らかとなった。さらに、TLSのC末端に位置するRGG3ドメインにRNAを添加して化学シフト摂動法により相互作用を解析した。これによりRGG3はRNAの5’側の1本鎖領域により強く結合することを示した。
TLSタンパク質は、テロメアDNAおよびテロメアDNAから転写されるRNAであるTERRAの四重鎖と結合して三者複合体を形成する。この複合体形成によりヒストンメチル基転移酵素がテロメア上にリクルートされ、テロメアの短縮をもたらす。四重鎖との結合を担うTLSのRGG3ドメインにテロメアDNAもしくはTERRAを単独で添加して、NMR法により相互作用様式を解析した。その結果、どちらの四重鎖に対しても同一のアミノ酸残基が結合に関与することが明らかとなった。さらに、テロメアDNAとTERRAを同時に加えて三者複合体を形成させた系で同様の解析を行ったところ、RGG3のフェニルアラニンを含む領域がテロメアDNA、チロシンを含む領域がTERRAに優先的に結合することが明らかになった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Cyclin D1 遺伝子由来のRNAのTLS結合領域について、二次構造を予定通りに決定し、TLSのRGG3ドメインと結合する箇所の特定に成功した。TLSの他のドメインとの結合に関する解析も並行して進行している。
テロメアDNAおよびTERRAの四重鎖とRGG3ドメインの結合様式に関しては、四重鎖との結合に関与するアミノ酸残基を特定し、三者複合体においてテロメアDNAとTERRAそれぞれに優先して結合する領域をNMR法により示した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
TLS全長の調製が困難であったことから、TLSの各ドメインとCyclin D1 遺伝子由来のRNAとの相互作用を解析することで、TLSのRNA認識機構を解明することとした。今後は各ドメインの大量発現・調製を行い、RNAとの複合体の解析を進める。また、テロメアDNA、TERRAとRGG3ドメインの三者複合体に関しては、選択的同位体標識など手法を使用してテロメアDNA-RGG3間およびTERRA-RGG3間の相互作用解析を進める。
|
| Causes of Carryover |
今年度はタンパク質のみの同位体標識を中心として複合体の解析を行ったため、予定よりも標識化に要する費用が少額となった。同位体標識した核酸を使用した解析については次年度に行う予定である。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
タンパク質と核酸の発現・精製に用いる試薬、核酸の合成費用、NMR測定用の試料管などの物品費、および成果の学会発表のための旅費、学会誌投稿料など
|
