2016 Fiscal Year Research-status Report
細胞間シグナル伝達を介した神経幹細胞の運命決定機構の解明
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15K18548
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
當麻 憲一 国立研究開発法人理化学研究所, 多細胞システム形成研究センター, 研究員 (30749205)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 細胞分化 / 細胞間シグナル / 大脳皮質 / 神経幹細胞 / 上層ニューロン / 核輸送 / 細胞接触 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、高次脳機能に関与する大脳皮質の上層ニューロンの分化決定を担う細胞間シグナル伝達の分子機構の解明を目的としている。
神経幹細胞は発生の進行に伴い分化能を切替えることで、深層ニューロン->上層ニューロンを決められた順番で経時的に産生する。前年度までに、神経幹細胞における核輸送阻害因子KPNA2による上層ニューロン分化決定因子Brn2の細胞内局在制御が深層/上層ニューロン産生期の切替を細胞間シグナル下流で担っていることを明らかにした。
今年度は、まずBrn2の局在パターンを直接的に操作することで上層ニューロン産生期への影響を調べた。その結果、Brn2の早期の核移行誘導で深層/上層ニューロン切替時期が早まること、逆にBrn2核移行阻害で切替時期が遅くなることがわかり、KPNA2-Brn2経路が深層/上層ニューロン切替えの主要経路であることがわかった。
次に、KPNA2-Brn2経路の上流である細胞間シグナルの伝達経路特定を試みた。予備実験から、分化後の深層ニューロンは神経幹細胞との接触を保っていることが見出されたので、その接着を解除する実験を行った。その結果、接着を解除した神経幹細胞からは深層ニューロンが産生され続けることがわかった。さらに相補実験として、神経幹細胞の試験管内培養系を開発し、深層ニューロンと神経幹細胞の共培養実験を行ったところ、接着条件下のみ上層ニューロンの産生期が早まることがわかった。これらの結果から、ニューロン-幹細胞間シグナルは液性因子ではなく細胞接触依存的に作動し、その下流でKPNA2-Brn2経路が上層ニューロン産生時期を決定しているという新規な機構を明らかにした。
当該分野では、神経幹細胞の分化能切替は細胞自律的機構に焦点が当てられて進められてきたが、本研究によって細胞外因子も協調的に関与していることが明らかになった点にインパクトがある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、昨年度同定したシグナル伝達経路の上流の細胞機構について明らかにすることができた。その過程で確立した試験管内での神経幹細胞の培養系を用い、予備的な表現系スクリーニングを数種類のシグナル伝達阻害剤を用いておこなったところ、当初予期していなかった上層ニューロンの分化を早期に誘導できる可能性がある小分子を発見することができた。
一方で、脳スライスイメージングによる深層ニューロンと神経幹細胞の接触動態の解析において、実験機器の故障等により十分なデータが得られていない。
計画内容に基づくとやや遅れているが、計画に含まれていない予期しない結果が得られたことから、当初予定していたものより高インパクトな論文に最終的にまとめられる可能性があるので、上記区分と判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度までで、上層ニューロンの分化を誘導する細胞間シグナルの伝達様式、下流経路について、新規のメカニズムを解明することができた。最終年度では、実際の大脳皮質発生における細胞接触動態の解析と、細胞間シグナルの分子実体を同定し、論文としてまとめる予定である。
細胞間シグナルの分子実体の同定には、今年度確立した神経幹細胞の試験管内培養系を用いて小規模スクリーニングを行う予定である。この際、すでに作成した深層ニューロンレポーターとしてtdTomato(Ctip2-tdTomato)、上層ニューロンレポーターとしてGFP(Brn2/Satb2-GFP)を発現するマウス系統を使用して、ハイコンテンツスクリーニングを行い上層ニューロンを選択的に分化誘導できるシグナル阻害剤を探索する。また、スクリーニング実験に伴うリスクヘッジとして既に予備実験で同定した候補因子について機能解析を進めている。
これらの解析を現在のデータに加え、ニューロン－幹細胞間シグナルの分子実体を含めた論文を最終的に作成する見込みである。
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| Causes of Carryover |
平成28年度に予定していた脳スライスのライブイメージング用顕微鏡において湿度制御異常によるレーザーの故障等が発生し、修理および培養、撮影条件の再検討により実験に遅れが生じた。論文投稿に必要なサンプル数を得るために、平成28年度末と平成29年度前半にかけてイメージングと画像解析を行う必要が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
計画書に記載の実験及びスクリーニング実験と、シグナル候補因子の機能解析実験に必要な試薬等消耗品費、また論文及び成果発表に必要な諸経費として使用する予定である。
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